Explants에서 들어라 기본 인간 기관지 상피 세포
Summary
우리가 공기 – 액체 인터페이스에서 차별화된 성장을 포함한 인간 기관지기도 조직의 explants에서 기본 인간 기관지 상피 세포의 성장에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 이 방법은 인간의 폐 건강과 질병의기도 상피의 역할을 조사하는 주요 세포의 풍부한 소스를 제공합니다.
Abstract
인간 기관지 상피 세포는 질병의 세포 모델에 필요한이며 기능과 인간의 상피 세포의 구조에 excipients 및 pharmacologic 대리인의 효과를 조사합니다. 여기 자세히 폐 수술 (예 : 폐암이나 폐 볼륨 감소 수술)의 시대에서 외과 의사에 의해 수확이다 기관지기도 조직의 기관지 상피 세포를 성장하는 방법을 설명합니다. 윤리 승인 및 통지 동의, 외과 병리에 필요한 무엇 소요되며 병에 걸린 지역에서 원격 기관지 부분으로 우리를 제공합니다. 조직은 다음 문화의 주요 기관지 상피 세포를 성장 사용할 수 explants의 소스로 사용됩니다. 0.5 – 1cm 길이 직경 ≤ 1cm에 대한 기관지 구간은 추위 EBSS 및 초과 parenchymal 조직 제거와 씻어서 있습니다. 세그먼트는 개방 절단 2~3mm에 다진 아르<sup> 3</sup> 조직 조각. 조각은 기본 세포의 원천으로 사용됩니다. 콜라겐의 조합 (30 μg / ML), fibronectin (10 μg / ML), 그리고 BSA (10 μg / ML)로 1-2 시간에 대한 코팅 100mm 문화 플레이트 후, 접시는 4-5 영역과 조직에 긁힌 아르 조각이 긁힌 부분에 배치됩니다 5 % CO에서 다음 상피 세포의 성장에 적합한 배지 (첨가제와 DMEM / 햄 F – 12)가 추가되고 플레이트는 37 인큐베이터에 배치됩니다 ° C를<sub> 2</sub> humidified 공기. 문화 매체는 모든 3-4일 변경됩니다. 상피 세포 3-4 주 약 1.5 cm 직경의 고리를 형성 조각에서 성장. Explants 새로운 사전 코팅 접시에 그들을 이동하여 6 회까지 다시 사용할 수 있습니다. 전지는 계산 풀링 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용 해제, 그들의 숫자를 증가 T75 셀 바인딩의 flasks에 다시 도금입니다. 2-3000000 세포는 4 주 동안 80 % 합류하기 위해 성장과 T75 flasks는 씨앗. 확대 기본 인간의 상피 세포는 교양과 공기 – 액체 인터페이스에서 차별화할 수 있습니다. 방법은 신선하게 분리된 조직에서 인간 기관지 상피 세포의 풍부한 소스를 제공하고 질병의 모델로 이들 세포를 연구 및 약리학 및 독성학 심사에 대해 허용을 여기에서 설명한.
Protocol
Discussion
본 연구에서는 우리는 문화와 기본 인간 기관지 상피 세포의 확장에 대한 자세한 방법을 제시. 우리는 explants과 상피 세포의 성장을 촉진 미디어 교양 기관지 조직,의 이식이 아닌 차별 (잠수)과 차별 (공기 – 액체 인터페이스에서 성장) 세포 모델 연구를위한 인간기도 상피 세포의 지속적인 소스를 제공하는 방법을 시연 . 이러한 전지는보다 밀접하게 그들의 진짜 physiologic 환경에서 세포 유사한되…
Acknowledgements
저자는 기관지 조직을 제공하는 박사 리차드 Inculet 매우 감사하고 있습니다. 연구 윤리위원회 승인은 성 요셉의 건강 해밀턴 및 웨스턴 온타리오 / 런던 건강 과학 센터 (박사 데이비드 매코맥), 조직 및 아카이브위원회, 병리의학과의 대학에서 얻은했다. 또한 immunostaining에 필요한 자료의 일부를 제공하는 우리의 알리 문화의 템즈와 다니엘라의 Farkas를 제공 어니 스핏쳐를 (전자 현미경, 맥매스터 대학교) 감사합니다. 이 작품은 온타리오 흉부 학회에서 차단 기간 부여에 의해 투자되었다; 박사 Asma Yaghi는 FSORC 장학금, 성 요셉의 건강, 해밀턴, 온타리오, 캐나다에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma | A4919 | Use for coating solution | |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma | C8919 | Use for coating solution | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma | F2006 | Use for coating solution | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution | |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma | D8437 | ||
| FBS | Sigma | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | BSA | |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma | P1476 | BPE | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | EGF | |
| (±)-Epinephrine | Sigma | E1635 | ||
| Insulin | Sigma | I6634 | ||
| Tranferrin Human | Sigma | T8158 | ||
| Triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | ||
| Hydorcortisone | Sigma | H0888 | ||
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | ||
| Trypsin | Sigma | T9935 | ||
| EDTA | Sigma | E6758 | EDTA | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P5368 | PBS | |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | |||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | ||
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth | |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution | |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma- Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution | |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody | |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma- Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa-Cruz | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody | |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa-Cruz | Use 1:100 dilution | ||
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence during prolonged storage | |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage | |
| Hoechst Stain solution | Sigma | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.
References
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