Первичные человеческие бронхиальные эпителиальные клетки, выращенных из эксплантов
Summary
Здесь мы опишем подробную метод выращивания первичных человеческих бронхиальных эпителиальных клеток из эксплантатов человека бронхиальной ткани дыхательных путей, в том числе дифференцированного роста на воздух-жидкость. Этот метод обеспечивает богатый источник первичных клеток для исследования роли дыхательных путей эпителия в области здоровья человека легких и болезней.
Abstract
Человек бронхиальные эпителиальные клетки необходимы для клеточной модели заболевания и исследовать влияние вспомогательных веществ и фармакологических агентов на функции и структуру человеческого эпителиальных клеток. Здесь мы подробно описать метод выращивания бронхиальных эпителиальных клеток бронхиальной ткани дыхательных путей, которые собирают хирург во времена легочной хирургии (например, рак легких или легкие сокращения объема операции). С этикой утверждения и информированное согласие, хирург берет то, что нужно для патологии и дает нам бронхиальной часть, удаленного от больных областях. Ткани затем используется в качестве источника эксплантов, которые можно использовать для выращивания первичной бронхиальной эпителиальных клеток в культуре. Бронхиальная сегментов примерно 0,5-1см долго и ≤ 1 см в диаметре промыть холодной EBSS и избыток паренхиматозной ткани удаляется. Сегменты разрезать и фарш на 2-3мм<sup> 3</sup> Кусочки ткани. Части используются в качестве источника первичной ячейки. После нанесения покрытия на 100 мм пластинах культуре в течение 1-2 часов с сочетанием коллагена (30 мкг / мл), фибронектин (10 мкг / мл) и BSA (10 мкг / мл), пластины почесал в 4-5 районах и ткани фигуры помещены в царапина, то питательной среды (DMEM / Хэма F-12 с добавками), пригодных для роста клеток эпителия добавляется и пластины помещены в термостат при температуре 37 ° С в 5% CO<sub> 2</sub> Увлажненного воздуха. Культуральной среде меняется каждые 3-4 дня. Эпителиальные клетки растут из частей составляет около 1,5 см в диаметре кольца в течение 3-4 недель. Эксплантов может быть повторно использован в 6 раз, перемещая их в новые предварительно покрытых пластинами. Клетки поднял использованием трипсин / ЭДТА, собирали, рассчитывали, и вновь помещают в колбы T75 сотовый Привязка к увеличению их числа. T75 Колбы с присадкой 2-3 миллионов клеток возрастет до 80% слияния в 4-х недель. Расширенное первичных человеческих клетках эпителия может быть культурным и позволила дифференцировать на воздухе жидкость. Методы, описанные здесь обеспечивают обильным источником человеческого бронхиальных эпителиальных клеток из свежих изолированных тканей и позволяют для изучения этих клеток в качестве модели заболевания и для фармакологии и токсикологии скрининга.
Protocol
Discussion
В этом исследовании мы представили подробные методы по культуре и расширение первичных человеческих бронхиальной эпителиальных клеток. Мы показали, как эксплантов и пересадки бронхиальной ткани, культивировали в средствах массовой информации, которые способствуют росту клеток эпит…
Acknowledgements
Авторы выражают глубокую благодарность д-р Ричард Inculet за предоставление бронхиальной ткани. Исследования этике совета утверждения были получены от здравоохранения Гамильтона Св. Иосифа и Университет Западного Онтарио / Лондон Центра медицинских наук (доктор Дэвид Маккормак), тканей и архива комитета, отдел патологии. Мы также благодарим Эрни Спитцер (электронная микроскопия, McMaster University) за предоставление ТОИ наших культур ALI, и Даниэла Фаркаш за предоставление некоторых материалов, необходимых для иммунной окраски. Эта работа финансировалась за счет гранта Блока срок от Онтарио торакального общества, доктор Асма Яги была поддержана FSORC стипендии, здравоохранение святого Иосифа, Гамильтон, Онтарио, Канада.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma | A4919 | Use for coating solution | |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma | C8919 | Use for coating solution | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma | F2006 | Use for coating solution | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution | |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma | D8437 | ||
| FBS | Sigma | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | BSA | |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma | P1476 | BPE | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | EGF | |
| (±)-Epinephrine | Sigma | E1635 | ||
| Insulin | Sigma | I6634 | ||
| Tranferrin Human | Sigma | T8158 | ||
| Triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | ||
| Hydorcortisone | Sigma | H0888 | ||
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | ||
| Trypsin | Sigma | T9935 | ||
| EDTA | Sigma | E6758 | EDTA | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P5368 | PBS | |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | |||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | ||
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth | |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution | |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma- Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution | |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody | |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma- Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa-Cruz | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody | |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa-Cruz | Use 1:100 dilution | ||
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence during prolonged storage | |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage | |
| Hoechst Stain solution | Sigma | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.
References
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts – Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
- Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
- Wetering, S. v. a. n. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
- Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
- Freshney, R. I., Freshney, R. I. . Culture of epithelial cells. , 1-23 (1992).
- Freshney, R. I., Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. , 181-196 (1992).
