Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri
Summary
Burada bir hava-sıvı arayüzü farklılaştırılmış büyüme de dahil olmak üzere insan bronşiyal solunum yolu doku eksplantlar birincil insan bronşiyal epitel hücreleri büyümek için detaylı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, insan akciğer sağlığı ve hastalıkları, solunum yolu epitel rolünü araştırmak için birincil hücreleri bol miktarda kaynak sağlar.
Abstract
İnsan bronşiyal epitel hücreleri hastalığın hücre modelleri için gerekli olan ve insan epitel hücrelerinin işlevi ve yapısı Yardımcı maddeler ve farmakolojik ajanların etkisini araştırmaktı. Burada akciğer ameliyatı (örneğin akciğer kanseri veya akciğer hacim küçültme ameliyatı) zaman cerrah tarafından hasat bronşiyal solunum yolu doku bronş epitel hücreleri büyüyen yöntemi ayrıntılı olarak açıklar. Etik onayı ve bilgilendirilmiş onam, cerrah patoloji için gerekli olan alır ve hastalıklı alanlar uzak bir bronş kısmı ile bize sunuyor. Dokusu primer bronş epitel hücreleri kültürde yetiştirmek için kullanılabilir eksplant kaynağı olarak kullanılır. 0.5-1cm uzunluğunda ve çapı ≤ 1cm hakkında Bronşiyal kesimleri, soğuk EBSS ve aşırı parankimal doku çıkarılır ile durulanır. Segmentler açık kesilmiş ve içine kıyılmış 2-3mm<sup> 3</sup> Doku parçaları. Adet birincil hücre kaynağı olarak kullanılır. Kollajen bir kombinasyonu (30 mg / ml), fibronektin (10 mg / ml) ve BSA (10 mg / ml) ile 1-2 saat süreyle kaplama 100mm kültür levhalar, plakalar, 4-5 alanlar ve doku çizik % 5 CO adet çizik alanlar yerleştirilir, daha sonra epitel hücre büyümesi için uygun bir kültür ortamı (katkı maddeleri ile DMEM / Ham F-12) eklenir ve levhalar 37 bir kuluçka yerleştirilir ° C<sub> 2</sub> Nemlendirilmiş hava. Kültür ortamı, her 3-4 günde bir değiştirilir. Epitel hücreleri, 3-4 hafta içinde yaklaşık 1,5 cm çapında halkalar oluşturan parçalardan büyür. Eksplantlarındaki yeni ön kaplı levhalar içine taşıyarak 6 kata kadar yeniden kullanılır olabilir. Hücreler sayılır toplanmış tripsin / EDTA, kaldırdı, T75 Cep Bind şişeler ve sayılarını artırmak için yeniden kaplanmıştır. T75 şişeler numaralı seribaşı 2-3 milyon hücre 4 hafta% 80 izdiham birlikte büyümek için. Genişletilmiş birincil insan epitel hücreleri, kültür ve hava-sıvı arayüzü ayırt etmek için izin verilebilir. Yöntem taze izole dokularda insan bronşiyal epitel hücreleri bol kaynak sağlamak ve bu hücrelerin hastalık modelleri olarak eğitim ve farmakoloji ve toksikoloji tarama izin olarak tanımlanmıştır.
Protocol
Discussion
Bu çalışmada, kültür ve primer insan bronş epitel hücreleri genişlemesi için ayrıntılı yöntemler sundu. Biz eksplantlar ve epitel hücre büyümesini teşvik medya kültürü bronşiyal doku, nakli, insan hava yolu epitel hücreleri olmayan diferansiye (batık) ve farklı (hava-sıvı arayüzü üzerinde yetişen) hücre modelleri çalışmaları için sürekli bir kaynak sağlamak nasıl gösterdi . Bu hücreler, kendi gerçek fizyolojik ortamlarda hücreler daha yakından benzediği uyuşturucu testi sist…
Acknowledgements
Yazarların bronşiyal dokular sağlamak için Dr. Richard Inculet müteşekkiriz. Joseph Sağlık Hamilton ve The University of Western Ontario / Londra Sağlık Bilimleri Merkezi (Dr David McCormack), Doku ve Arşivler Komitesi, Patoloji Anabilim Dalı Araştırma Etik Kurul onayı alındı. Ayrıca bazı immün için gerekli malzemelerin sağlanması için ALI kültürlerin dardı ve Daniela Farkas sağlamak için Ernie Spitzer (Elektron Mikroskop, McMaster Üniversitesi) teşekkür ederim. Bu çalışma, Ontario Toraks Derneği Blok vadeli hibe ile finanse edilmiştir; Dr. Esma Yaghi FSORC burs, St Joseph Sağlık, Hamilton, Ontario, Kanada tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma | A4919 | Use for coating solution | |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma | C8919 | Use for coating solution | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma | F2006 | Use for coating solution | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution | |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma | D8437 | ||
| FBS | Sigma | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | BSA | |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma | P1476 | BPE | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | EGF | |
| (±)-Epinephrine | Sigma | E1635 | ||
| Insulin | Sigma | I6634 | ||
| Tranferrin Human | Sigma | T8158 | ||
| Triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | ||
| Hydorcortisone | Sigma | H0888 | ||
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | ||
| Trypsin | Sigma | T9935 | ||
| EDTA | Sigma | E6758 | EDTA | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P5368 | PBS | |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | |||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | ||
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth | |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution | |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma- Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution | |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody | |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma- Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa-Cruz | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody | |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa-Cruz | Use 1:100 dilution | ||
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence during prolonged storage | |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage | |
| Hoechst Stain solution | Sigma | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.
References
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts – Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
- Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
- Wetering, S. v. a. n. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
- Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
- Freshney, R. I., Freshney, R. I. . Culture of epithelial cells. , 1-23 (1992).
- Freshney, R. I., Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. , 181-196 (1992).
