Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41
Summary
Mama ist eine einzigartige Magnetosom assoziierten Protein, das nachweislich in Magnetosomen Aktivierung beteiligt sein sollte. Hier präsentieren wir die Aufreinigungsprotokolls von Mama Deletionsmutante (MamAΔ41) aus<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Abstract
Magnetotaktische Bakterien umfassen eine heterogene Gruppe von aquatischen Mikroorganismen, die in der Lage, sich entlang geomagnetischen Feldern orientieren werden. Dieses Verhalten wird angenommen, dass die Suche nach geeigneten Umgebungen Hilfe<em> (1)</em>. Diese Fähigkeit der Magnetosomen verliehen wird, Bläschen eine subzelluläre Organelle, die aus einer linearen Kette Montage von Lipid besteht jeder in der Lage, biomineralize und legen Sie ein ~ 50-nm-Kristall von Magnetit oder Greigit. Eine Hauptkomponente der Magnetosomen, die nachweislich für die Bildung von funktionalen Vesikeln erforderlich war, ist Mama. Mama ist eine sehr reichliche Magnetosomen-assoziierten Protein, das eine der am besten charakterisierte Magnetosomen-assoziierten Proteinen ist<em> In vivo</em><em> (2-6)</em>. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Reinigung von Mama, die, obwohl sie studiert<em> In vivo</em>, Haben keine klaren funktionellen oder strukturellen Details für sie identifiziert worden. Bioinformatik Analyse ergab, dass Mama ein Tetra-tricopeptide wiederholen (TPR), die Protein ist. TPR ist ein Strukturmotiv als solches oder als Teil eines größeren fach in einer Vielzahl von Proteinen gefunden, es dient als Vorlage für die Protein-Protein Interaktionen und vermittelt Multi-Protein-Komplexe<em> (7)</em>. TPRs sind in vielen wichtigen Aufgaben in eukaryotischen Zellorganellen Prozesse und vieler bakterieller Signalwege beteiligt<em> (8-14).</em> Um Mama zu verstehen, ein einmaliges TPR enthält Eiweiß, ist hoch gereinigtes Protein in einem ersten Schritt erforderlich. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen die Reinigung Protokoll für eine stabile Mama Deletionsmutante (MamAΔ41) aus<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Protocol
Discussion
Proteinreinigung ist der wichtigste Schritt in jedem Proteine biochemische oder strukturelle Untersuchungen. Da jedes Protein ist einzigartig mit seinen eigenen Verhaltens, braucht man, um seine Eigenschaften zu definieren und ändern ihre Reinigung entsprechend. Zielprotein sollte als ein erster Schritt zur Reinigung mit bioinformatischen Methoden analysiert werden. Sie werden verwendet, um das Ziel iso-elektrischen Punkt zu berechnen, bewerten ihre Notwendigkeit für reduzierende / oxidierende Umwelt und ihrer N…
Acknowledgements
Wir danken Dr. Amir Aharoni für seine Unterstützung und Geula Dawydow, Noam Grimberg und Chen Guttman für ihre Ratschläge und Kommentare.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French Press | Equipment | Thermo scientific | FA-078A | |
| Pressure cell | Equipment | Thermo scientific | FA-032 | |
| Ultra-centrifuge | Equipment | Sorvall | Discovery 90SE | |
| Rottor | Equipment | Beckman | Ti60 | |
| Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Equipment | Beckman | BC-355618 | |
| 2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns | Equipment | BioRad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind resin | Equipment | Novagen | M0063428 | |
| Spectrophotometer | Equipment | Amersham Biosiences | Ultraspec 2100 pro | |
| Quartz cuvette | Equipment | Hellma | 104-QS | |
| Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 28-4062-64 | |
| Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 10025543 | |
| Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 17-1071-01 | |
| Centricon – Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Equipment | Sartorius Stedim Biotech GmbH | VS1501 | |
| Table centrifuge | Equipment | Thermo scientific | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Equipment | Bruker Daltonics | Reflex IV | |
| Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane | Reagent | BioLab | 20092391 | |
| Sodium Chloride | Reagent | FRUTROM | 235553470 | |
| Imidazole | Reagent | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| EDTA free protease inhibitors cocktail | Reagent | Sigma | P-8849 | |
| Dnase I (Deoxyribonuclease I) | Reagent | Sigma | DN-25 | |
| Bovine Thrombin | Reagent | Fisher BioReagents | BP25432 | |
| Glycine | Reagent | BioLab | 07132391 | |
| Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) | Reagent | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M-3148 | |
| InstantBlue | Reagent | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagent | Fermentas | SM0671 |
References
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