के शोधन एम. magneticum तनाव Magnetosome एसोसिएटेड प्रोटीन MamAΔ41-1 AMB
Summary
माँ एक अनूठा Magnetosome जुड़े प्रोटीन जो magnetosome सक्रियण में शामिल होना दिखाया गया था. हम यहाँ से माँ विलोपन उत्परिवर्ती की शुद्धि प्रोटोकॉल (MamAΔ41) वर्तमान<em> एम. magneticum</em> AMB-1.
Abstract
Magnetotactic बैक्टीरिया जलीय सूक्ष्मजीवों कि खुद geomagnetic क्षेत्रों के साथ मालूम करने में सक्षम हैं की एक विविध समूह शामिल हैं. इस व्यवहार के लिए उपयुक्त वातावरण के लिए अपने खोज सहायता माना जाता है<em> (1)</em>. यह क्षमता magnetosome द्वारा प्रदत्त है, एक subcellular organelle कि लिपिड का एक रेखीय श्रृंखला विधानसभा के होते हैं प्रत्येक के लिए biomineralize और मैग्नेटाइट या greigite के ~ 50 एनएम क्रिस्टल संलग्न करने में सक्षम vesicles. Magnetosome कि कार्यात्मक vesicles के गठन के लिए आवश्यक होना दिखाया गया था का एक सिद्धांत घटक माँ है. माँ अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन magnetosome जुड़े है जो एक सबसे विशेषता magnetosome जुड़े प्रोटीन की है<em> Vivo में</em><em> (2-6)</em>. यह आलेख माँ की शुद्धि पर केंद्रित है, जो अध्ययन किया जा रहा है के बावजूद<em> Vivo में</em> कोई स्पष्ट कार्यात्मक या संरचनात्मक विवरण के लिए पहचान की गई है. जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण का सुझाव दिया है कि माँ एक tetra-tricopeptide (TPR) दोहराने प्रोटीन युक्त है. TPR एक संरचनात्मक प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला में एक बड़ा गुना के ऐसे या बनाने हिस्से के रूप में पाया आकृति है, यह प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत mediates और परिसरों बहु – प्रोटीन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है<em> (7)</em>. TPRs यूकेरियोटिक सेल organelle प्रक्रियाओं और कई बैक्टीरिया रास्ते में कई महत्वपूर्ण कार्यों में शामिल हैं<em> (14/08).</em> क्रम में माँ को समझने के लिए, एक अद्वितीय प्रोटीन युक्त TPR, उच्च शुद्ध प्रोटीन एक पहला कदम के रूप में आवश्यक है. इस अनुच्छेद में, हम से एक स्थिर माँ विलोपन उत्परिवर्ती (MamAΔ41) के लिए शुद्धि प्रोटोकॉल वर्तमान<em> एम. magneticum</em> AMB-1.
Protocol
Discussion
प्रोटीन शुद्धीकरण किसी भी जैव रासायनिक प्रोटीन या संरचनात्मक अध्ययन में मुख्य कदम है. चूंकि प्रत्येक प्रोटीन अपने स्वयं के व्यवहार के साथ अद्वितीय है, उसके गुणों को परिभाषित करने के लिए और इसकी शुद्ध…
Acknowledgements
हम अपने और उनकी सलाह और टिप्पणियों के लिए समर्थन Geula Davidov, नोम Grimberg और चेन Guttman के लिए डॉ. आमिर Aharoni स्वीकार करते हैं.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French Press | Equipment | Thermo scientific | FA-078A | |
| Pressure cell | Equipment | Thermo scientific | FA-032 | |
| Ultra-centrifuge | Equipment | Sorvall | Discovery 90SE | |
| Rottor | Equipment | Beckman | Ti60 | |
| Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Equipment | Beckman | BC-355618 | |
| 2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns | Equipment | BioRad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind resin | Equipment | Novagen | M0063428 | |
| Spectrophotometer | Equipment | Amersham Biosiences | Ultraspec 2100 pro | |
| Quartz cuvette | Equipment | Hellma | 104-QS | |
| Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 28-4062-64 | |
| Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 10025543 | |
| Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 17-1071-01 | |
| Centricon – Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Equipment | Sartorius Stedim Biotech GmbH | VS1501 | |
| Table centrifuge | Equipment | Thermo scientific | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Equipment | Bruker Daltonics | Reflex IV | |
| Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane | Reagent | BioLab | 20092391 | |
| Sodium Chloride | Reagent | FRUTROM | 235553470 | |
| Imidazole | Reagent | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| EDTA free protease inhibitors cocktail | Reagent | Sigma | P-8849 | |
| Dnase I (Deoxyribonuclease I) | Reagent | Sigma | DN-25 | |
| Bovine Thrombin | Reagent | Fisher BioReagents | BP25432 | |
| Glycine | Reagent | BioLab | 07132391 | |
| Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) | Reagent | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M-3148 | |
| InstantBlue | Reagent | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagent | Fermentas | SM0671 |
References
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes. Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).
- D’Andrea, L. D., Regan, L. TPR proteins: the versatile helix. Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).
- Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. l. r. i. c. h., F, . More than folding: localized functions of cytosolic chaperones. Trends Biochem Sci. 28, 541-547 (2003).
- Brocard, C., Hartig, A. Peroxisome targeting signal 1: is it really a simple tripeptide?. Biochim Biophys Acta. 1763, 1565-1573 (2006).
- Fransen, M., Amery, L., Hartig, A., Brees, C., Rabijns, A., Mannaerts, G. P., Van Veldhoven, P. P. Comparison of the PTS1- and Rab8b-binding properties of Pex5p and Pex5Rp/TRIP8b. Biochim Biophys Acta. 1783, 864-873 (2008).
- Baker, M. J., Frazier, A. E., Gulbis, J. M., Ryan, M. T. Mitochondrial protein-import machinery: correlating structure with function. Trends Cell Biol. 17, 456-464 (2007).
- Mirus, O., Bionda, T., von Haeseler, A., Schleiff, E. Evolutionarily evolved discriminators in the 3-TPR domain of the Toc64 family involved in protein translocation at the outer membrane of chloroplasts and mitochondria. J Mol Model. 15, 971-982 (2009).
- Gatsos, X., Perry, A. J., Anwari, K., Dolezal, P., Wolynec, P. P., Likic, V. A., Purcell, A. W., Buchanan, S. K., Lithgow, T. Protein secretion and outer membrane assembly in Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol Rev. 32, 995-1009 (2008).
- Tiwari, D., Singh, R. K., Goswami, K., Verma, S. K., Prakash, B., Nandicoori, V. K. Key residues in Mycobacterium tuberculosis protein kinase G play a role in regulating kinase activity and survival in the host. J Biol Chem. 284, 27467-27479 (2009).
- Edqvist, P. J., Broms, J. E., Betts, H. J., Forsberg, A., Pallen, M. J., Francis, M. S. Tetratricopeptide repeats in the type III secretion chaperone, LcrH: their role in substrate binding and secretion. Mol Microbiol. 59, 31-44 (2006).
- Grunberg, K., Muller, E. C., Otto, A., Reszka, R., Linder, D., Kube, M., Reinhardt, R., Schuler, D. Biochemical and proteomic analysis of the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Appl Environ Microbiol. 70, 1040-1050 (2004).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 3839-3843 (2004).
- Okuda, Y., Fukumori, Y. Expression and characterization of a magnetosome-associated protein, TPR-containing MAM22, in Escherichia coli. FEBS Lett. 491, 169-173 (2001).
- Taoka, A., Asada, R., Sasaki, H., Anzawa, K., Wu, L. F., Fukumori, Y. Spatial localizations of Mam22 and Mam12 in the magnetosomes of Magnetospirillum magnetotacticum. J Bacteriol. 188, 3805-3812 (2006).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
