の精製 M. magneticum株AMB - 1 Magnetosome関連タンパク質MamAΔ41
Summary
ママはmagnetosome活性化に関与することが示されていたユニークなMagnetosome関連するタンパク質である。ここでは、からママ欠失変異体（MamAΔ41）の精製のプロトコールを提示<em> M. magneticum</em> AMB – 1。
Abstract
走磁性細菌は、地磁気のフィールドに沿って自分自身をオリエンテーションすることができる水生微生物の多様なグループを構成。この動作は、適切な環境のための彼らの検索を支援するために考えられている<em>（1）</em>。この機能はmagnetosomeにより付与され、脂質の直鎖アセンブリから構成される細胞内小器官は、マグネタイトまたはグレイジャイトの〜50 nmの結晶をbiomineralizeと囲むようにそれぞれができるように小胞。機能的な小胞の形成に必要なことが示されmagnetosomeの主成分はママです。ママは最も特徴付けmagnetosome関連タンパク質の一つである非常に豊富magnetosome関連タンパク質である<em> in vivoで</em><em>（2-6）</em>。この記事では、ママの浄化に焦点を当てている研究されているにもかかわらず<em> in vivoで</em>、明確な機能的または構造的細部は、それのために同定されていない。バイオインフォマティクス解析には、ママがタンパク質を含むテトラ- tricopeptideリピート（TPR）であることが示唆された。 TPRは、蛋白質の広い範囲で大きな倍のようなまたは一部を形成するように見られる構造モチーフである、それはタンパク質 – タンパク質相互作用を媒介多タンパク質複合体のテンプレートとして機能<em>（7）</em>。 TPRsは、真核細胞オルガネラのプロセスと多くの細菌の経路で、多くの重要なタスクに関与している<em>（8-14）。</emママ、タンパク質を含む独自のTPRを理解する>ためには、高度に精製されたタンパク質は、最初のステップとして必要です。この記事では、我々はより安定したママ欠失変異体（MamAΔ41）の精製のプロトコールを提示<em> M. magneticum</em> AMB – 1。
Protocol
1。 E.のママの遺伝子のクローニングと発現大腸菌 5' – GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG – 3'および5' – GCGCGGCAGCCATA – TGGCATACG – 3'：変異遺伝子mamAΔ41はプライマーと、Magnetospirillum magneticum AMB – 1のゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて増幅した。増幅したDNA断片では、NcoIサイトは、開始コドンATGで導入され、終止コドンは、ScoI…
Discussion
タンパク質の精製は、任意のタンパク質生化学的または構造的な研究の主要なステップです。それぞれの蛋白質がそれ自身の動作と一意であるため、人はそのプロパティを定義し、それに応じてその精製を変更する必要があります。蛋白質のターゲットは、バイオインフォマティクスのツールを使用して精製するための第一歩として分析する必要があります。彼らは、環境と特殊なイオン/配…
Acknowledgements
我々は、彼らのアドバイスやコメントのための彼のサポートとGeula Davidov、ノームGrimbergと陳グットマンのために博士アミールAharoniを認めます。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French Press | Equipment | Thermo scientific | FA-078A | |
| Pressure cell | Equipment | Thermo scientific | FA-032 | |
| Ultra-centrifuge | Equipment | Sorvall | Discovery 90SE | |
| Rottor | Equipment | Beckman | Ti60 | |
| Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Equipment | Beckman | BC-355618 | |
| 2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns | Equipment | BioRad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind resin | Equipment | Novagen | M0063428 | |
| Spectrophotometer | Equipment | Amersham Biosiences | Ultraspec 2100 pro | |
| Quartz cuvette | Equipment | Hellma | 104-QS | |
| Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 28-4062-64 | |
| Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 10025543 | |
| Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 17-1071-01 | |
| Centricon – Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Equipment | Sartorius Stedim Biotech GmbH | VS1501 | |
| Table centrifuge | Equipment | Thermo scientific | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Equipment | Bruker Daltonics | Reflex IV | |
| Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane | Reagent | BioLab | 20092391 | |
| Sodium Chloride | Reagent | FRUTROM | 235553470 | |
| Imidazole | Reagent | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| EDTA free protease inhibitors cocktail | Reagent | Sigma | P-8849 | |
| Dnase I (Deoxyribonuclease I) | Reagent | Sigma | DN-25 | |
| Bovine Thrombin | Reagent | Fisher BioReagents | BP25432 | |
| Glycine | Reagent | BioLab | 07132391 | |
| Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) | Reagent | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M-3148 | |
| InstantBlue | Reagent | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagent | Fermentas | SM0671 |
References
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PurificationM. MagneticumStrain AMB-1Magnetosome Associated ProteinMamAΔ41Magnetotactic BacteriaGeomagnetic FieldsMagnetosomeLipid VesiclesBiomineralizeMagnetiteGreigiteFunctional VesiclesMagnetosome-associated ProteinPurification Of MamAFunctional DetailsStructural DetailsBioinformatics AnalysisTetra-tricopeptide Repeat (TPR)Protein-protein InteractionsMulti-protein ComplexesEukaryotic Cell Organelle ProcessesBacterial Pathways
Citer Cet Article
Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41. J. Vis. Exp. (37), e1844, doi:10.3791/1844 (2010).