स्ट्रक्चरल बायोलॉजी के अध्ययन के लिए इलेक्ट्रॉन क्रि द्वारा लघु झिल्ली प्रोटीन के दो आयामी Crystallization परीक्षण मूल्यांकन
Summary
आदेश दिया झिल्ली प्रोटीन arrays के गठन के लिए दो आयामी (2d) crystallization परीक्षण का मूल्यांकन इलेक्ट्रॉन क्रि में एक बेहद महत्वपूर्ण और मुश्किल काम है. 90kDa – हम यहाँ के लिए स्क्रीनिंग और 15 की रेंज में मुख्य रूप से छोटे झिल्ली प्रोटीन की 2D क्रिस्टल की पहचान में हमारे दृष्टिकोण का वर्णन.
Abstract
इलेक्ट्रॉन क्रि एक तरीका है कि या तो वैकल्पिक रूप से या तीन आयामी crystallization और एक्स – रे क्रि झिल्ली प्रोटीन की संरचना समारोह सवाल है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से घुलनशील प्रोटीन का अध्ययन करने के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में विकसित किया गया है. दो आयामी (2d) के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा क्रिस्टल के लिए स्क्रीनिंग (EM) को ढूँढने में महत्वपूर्ण कदम है, अनुकूलन, और क्रायो-EM द्वारा उच्च संकल्प डेटा संग्रह के लिए नमूने का चयन. यहाँ हम दोनों बड़े और आदेश दिया, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से छोटे 2 डी सरणियों, कि संभावित crystallization शर्तों के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण जानकारी की आपूर्ति कर सकते हैं की पहचान करने में बुनियादी कदम का वर्णन.
EM पर विभिन्न magnifications के साथ काम करके, महत्वपूर्ण पैरामीटर की एक श्रृंखला पर डेटा प्राप्त की है. लोअर बढ़ाई आकारिकी और झिल्ली के आकार पर मूल्यवान डेटा की आपूर्ति करता है. उच्च magnifications में, संभव क्रम और 2d क्रिस्टल आयाम निर्धारित होते हैं. इस संदर्भ में, यह वर्णित है कैसे सीसीडी कैमरों और ऑनलाइन – फूरियर रूपांतरण उच्च magnifications पर इस्तेमाल कर रहे हैं करने के लिए आदेश और आकार के लिए proteoliposomes का आकलन है.
जबकि झिल्ली प्रोटीन की 2D क्रिस्टल सबसे अधिक डायलिसिस द्वारा पुनर्गठन द्वारा बड़े हो रहे हैं, स्क्रीनिंग तकनीक monolayers, देशी 2D क्रिस्टल की मदद के साथ उत्पादित क्रिस्टल के लिए समान रूप से लागू है, और घुलनशील प्रोटीन की सरणियों का आदेश दिया. इसके अलावा, यहाँ वर्णित विधियों को भी छोटे 2 डी क्रिस्टल के रूप में अच्छी तरह के रूप में बड़ा झिल्ली प्रोटीन, जहां छोटे प्रोटीन की पहचान में हमारे बड़े प्रोटीन की जाली और उदाहरण के रूप में देखभाल के एक ही राशि की आवश्यकता के लिए स्क्रीनिंग के लिए लागू कर रहे हैं और अधिक आसानी से पहचाने जाने योग्य हो सकता है स्क्रीनिंग के पहले चरण में.
Protocol
Discussion
नमूनों के उचित मूल्यांकन झिल्ली के एक पर्याप्त संख्या के सावधान मूल्यांकन की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, के रूप में कम 2% के रूप में 180 से अधिक imaged proteoliposomes की क्रिस्टलीय सरणियों के साथ नमूने 2D crystallization 7 शर्त?…
Acknowledgements
हम बहुमूल्य प्रोटीन के नमूने, जो हमारे तरीके से संबंधित अनुभव और टिप्पणियों के कुछ योगदान प्रदान करने के लिए अपने सहयोगियों का धन्यवाद. गुंठर Schmalzing कृपया FR करने का अवसर प्रदान करने के लिए इस परियोजना में शामिल होने. बारबरा Armbruster, याकूब कगार और Deryck मिल्स उनके बकाया मदद और उपकरणों पर इनपुट के लिए धन्यवाद दिया. अनुदान NIH अनुदान HL090630 द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | ||||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | |||
| Micropipette and pipette tips | ||||
| Whatman #4 filter paper | ||||
| 1% uranyl acetate | ||||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | ||||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | |||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
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