La evaluación de dos dimensiones ensayos de cristalización de proteínas de membrana pequeña de Estudios de Biología Estructural de Cristalografía de electrones
Summary
La evaluación de dos dimensiones (2D) ensayos de cristalización para la formación de matrices de orden de proteínas de membrana es una tarea muy difícil y crítica de la cristalografía de electrones. A continuación se describe el enfoque en la detección e identificación de cristales 2D de proteínas de la membrana en su mayoría pequeñas en el rango de 15 – 90kDa.
Abstract
Cristalografía de electrones se ha desarrollado como un método que puede ser utilizado como alternativa o en combinación con tres dimensiones de cristalización y cristalografía de rayos X para estudiar la estructura-función de las preguntas de proteínas de membrana, así como proteínas solubles. La detección de dos dimensiones (2D) los cristales mediante microscopía electrónica de transmisión (EM) es el paso crítico en la búsqueda, la optimización y selección de muestras de alta resolución de la recopilación de datos de la crio-ME. A continuación se describen los pasos fundamentales en la identificación de grandes y ordenadas, así como pequeños arreglos en 2D, que potencialmente puede proveer información crítica para la optimización de las condiciones de cristalización.
Al trabajar con diferentes aumentos en la EM, los datos sobre una serie de parámetros críticos se obtiene. Menor aumento suministra datos valiosos sobre la morfología y el tamaño de la membrana. A mayores aumentos, las posibles dimensiones de cristal para 2D y se determinan. En este contexto, se describe cómo las cámaras CCD y se transforma en línea de Fourier se utilizan en mayores aumentos para evaluar proteoliposomas por el orden y el tamaño.
Mientras que los cristales 2D de proteínas de membrana son más cultivadas por la reconstitución por diálisis, la técnica de detección es igualmente aplicable para los cristales producidos con la ayuda de las monocapas, nativo de cristales 2D, y ordenó a las matrices de proteínas solubles. Además, los métodos descritos aquí son aplicables a la detección de cristales 2D de la aún más pequeña, así como proteínas de membrana más grandes, donde los pequeños las proteínas requieren la misma cantidad de atención en la identificación de los ejemplos y la red de proteínas más grandes pueden ser más fácilmente identificables en las primeras etapas de la selección.
Protocol
Discussion
Evaluación adecuada de las muestras requiere una evaluación cuidadosa de un número suficiente de las membranas. Por ejemplo, las muestras con precios tan bajos como 2% de las matrices cristalinas de más de 180 proteoliposomas imágenes dieron la información crítica para la optimización rápida de las condiciones de cristalización 2D 7.
Cuando la precipitación de la proteína se produce, una red puede ser abandonada a partir de una mayor búsqueda después de la inspecció…
Acknowledgements
Agradecemos a nuestros colaboradores para proporcionar valiosas muestras de proteínas, lo que contribuyó a algunas de nuestras experiencias relacionadas con los métodos y observaciones. Günther Schmalzing amablemente ofreció la oportunidad de FR a unirse a este proyecto. Barbara Armbruster, Brink y Jacob Mills Deryck se les agradece por su gran ayuda y de entrada en el equipo. El financiamiento fue proporcionado por el NIH subvención HL090630.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | ||||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | |||
| Micropipette and pipette tips | ||||
| Whatman #4 filter paper | ||||
| 1% uranyl acetate | ||||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | ||||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | |||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
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