Den electroolfactogram (EOG) inspelning är en informativ, lätt att genomföra, och tillförlitligt sätt att bedöma lukt-funktion på samma nivå som luktepitel. Detta protokoll beskriver en inspelning setup, mus vävnad förberedelse, datainsamling, och grundläggande analys av data.
Djur är beroende av luktsinne för många kritiska beteenden, som att hitta mat källor, undvika rovdjur, och att identifiera artfränder för parning och andra sociala interaktioner. Den electroolfactogram (EOG) inspelning är en informativ, lätt att genomföra, och tillförlitlig metod att analysera lukt funktion på nivå luktepitel. Sedan 1956 beskrivningen av EOG av Ottoson hos grodor 1 har EOG inspelning tillämpats i många ryggradsdjur, inklusive salamandrar, kaniner, råttor, möss och människor (granskats av Scott och Scott-Johnson, 2002, ref. 2). De senaste framstegen inom genetisk modifiering på möss har återuppväckt intresset för att spela in EOG för fysiologisk karakterisering av luktsinnet fungerar i knock-out och knock-i möss. EOG inspelningar har tillämpats med framgång för att påvisa den centrala roll som luktsinnet komponenter signaltransduktion 3-8, och på senare tid för att karakterisera bidrag vissa regulatoriska mekanismer för att OSN svar 9-12.
Luktämnen detektion sker vid ytan av luktepitel på flimmerhåren i OSN, där en signaltransduktion kaskad leder till öppning av jonkanaler, genererar en ström som rinner ut i flimmerhåren och depolarizes membranet 13. Det EOG är den negativa potentiella inspelade extracellularly på ytan av luktepitel på luktämnen stimulans, till följd av en summering av eventuella förändringar som orsakas av enskilda lyhörd OSN i inspelningen område 2. Jämförelse av amplitud och kinetik för EOG ger därigenom värdefull information om hur genetisk modifiering och andra experimentella manipulationer påverka molekylär signalering som ligger bakom OSN svar på lukt.
Här beskriver vi en luft-fas EOG inspelning på en beredning av mus lukt näsmusslan. Kortfattat, efter offra musen, är luktsinnet näsmusslan exponeras av Halvera huvudet längs mittlinjen och ta bort membranet. Den turbinata preparatet placeras sedan i inspelningen setup, och en inspelning elektrod placeras på ytan av luktepitel på en av de mediala näsmusslan. En referens elektrod är elektriskt ansluten till vävnaden genom en buffertlösning. En kontinuerlig ström av fuktad luft blåses över ytan av epitelet att hålla den fuktig. Den ånga av luktämnen lösningar är uppblåst i strömmen av fuktad luft för att stimulera epitelet. Svaren registreras och digitaliseras för vidare analys.
Med installationen som beskrivs i detta protokoll kommer luktämnen stimuli på ytan av luktepitel vara konsekvent mellan vävnad förberedelser som möjliggör jämförelser mellan vildtyp och muterade möss, även om den exakta luktämnen koncentration och dynamik är okända. Flera faktorer, särskilt inspelningen plats och flödet av fuktad luft, orsaka variationer i EOG. Försiktighet bör vidtas för att spela in från liknande positioner på samma turbinata att minimera variation. Detta kan lätt uppnås genom att konsekvent inspelning från samma sida av huvudet och hålla fotavtryck av mikroskopet, lukt leverans rör och micromanipulators på luft bordet oförändrad mellan vävnadsprover. Dessutom bör vävnadsprover omedelbart placeras i fuktad luft strömma efter dissektion för att förhindra överdriven torkning av vävnad.
EOG inspelningar på möss kan också utföras med en vätska perfusion apparaten på beredd musen näsmusslan 7, 14, 15 eller genom att lämna huvudet intakt och sätta in elektroden i ett litet hål borras ovanför näsmusslan 16, 17. Varje variation av EOG inspelningen har sina egna styrkor: luft-fas inspelningar på vävnad förberedelser som beskrivs i detta protokoll kräver en minimal mängd av installation och är lättast att genomföra, inspelningar med en flytande perfusion apparat underlätta användningen av farmakologiska reagenser, även om hydrofoba karaktären hos många doftämnen komplicerar lukt leverans, slutligen, kan inspelningar där huvudet är kvar intakt användas i "konstgjorda sniffa" experiment, även om elektrodplacering är svårare än när näsmusslan är fullt exponerad.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Yijun Song, och medlemmar av den Hattar Kuruvilla Zhao tri-lab vid Institutionen för biologi, Johns Hopkins University för att få råd och hjälp. Med stöd av NIH bidrag DC007395 och DC009946.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Air delivery tube | equipment | Custom fabricated | The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute | |
Air table | equipment | Newport | LW3030B-OPT | |
Amplifier | equipment | Warner | DP-301 | |
Computer and Data Acquisition Software | equipment | Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh | Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/. | |
Butane torch | equipment | A crème brûlèe torch works well | ||
Digitizer | equipment | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
Dissecting Scope | equipment | Scienscope | SSZ | |
Electrode holder | equipment | Harvard Apparatus | 64-1021 | |
Magnetic Holding Devices (12 mm) | equipment | World Precision Instruments | M10 | |
Micromanipulators | equipment | World Precision Instruments | M3301R M3301L |
|
Micropipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P2000 | |
Oscilloscope | equipment | Tektronix | 5110 | |
Picospritzer III | equipment | Parker Instrumentation | ||
Silicone tubing | equipment | Nalge Nunc | ||
Specimen stage | equipment | Custom fabricated | Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay. | |
18 gage needles | material | Becton Dickinson | 305195 | |
2 oz. glass bottles | material | VWR International | 16152-201 | |
Glass capillaries | material | World Precision Instruments | TW150F-6 | |
Silicone stoppers size 16D | material | Chemware | D1069809 | |
Silver wire | material | World Precision Instruments | AGW1010 | |
SylGuard 184 | material | Dow Corning | SYLG184 | From World Precision Instruments |
Agarose | reagent | Invitrogen | 15510-027 | |
Amyl acetate | reagent | Aldrich | W504009 | |
Calcium chloride (CaCl2) | reagent | Sigma | C-1016 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | reagent | Sigma | D5879 | |
HEPES | reagent | Fisher | BP310 | |
Heptaldehyde | reagent | Aldrich | H2120 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O) | reagent | Sigma | M9272 | |
Sodium chloride (NaCl) | reagent | JT Baker | 3624-05 | |
flowmeter | equipment | Gilmont | GF-2260 |