العزلة والإثراء من خلايا فأر الجذعية الوسيطة (MSCS) والفصل بين مستعمرة واحدة مشتقة اللجان الدائمة
Summary
وكانت الفئران المعزولة من اللجان الدائمة وfemurs tibias وإثراء ثم فرز الخلايا المغناطيسية. وتأكدت الخلايا فرز للتعبير عن السطح علامات التدفق الخلوي. وكانت أيضا هذه الخلايا المستزرعة في كثافة نسيلي لتشكيل المستعمرات واحدة ثم تم فصل هذه المستعمرات التي اسطوانات الاستنساخ.
Abstract
اللجان الدائمة هي مجموعة من الخلايا الجذعية البالغة التي هي مصدر واعد للتطبيقات علاجية. يمكن عزل هذه الخلايا من نخاع العظم ويمكن فصلها بسهولة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) بسبب تمسكهم البلاستيك. هذا البروتوكول يصف كيفية عزل من اللجان الدائمة وtibias femurs الفئران. وإثراء للخلايا معزولة ضد اثنين من علامات سطح اللجان الدائمة CD54 CD90 والفرز من قبل خلية المغناطيسي. ثم تأكدت من علامات التعبير والسطحية CD54 CD90 عن طريق تحليل التدفق الخلوي. كما تم تضمين علامة HSC CD45 للتحقق مما إذا كانت اللجان الدائمة استنزاف فرزها من HSCs. اللجان الدائمة هي بطبيعة الحال غير متجانسة تماما. هناك مجموعات سكانية فرعية من الخلايا التي تحتوي على أشكال مختلفة ، وقدرات الانتشار التمايز. هذه المجموعات السكانية الفرعية تعبر عن جميع اللجان الدائمة وعلامات معروفة لم تكن هناك علامة فريدة لتحديد الشرائح السكانية المختلفة. لذلك ، نهجا بديلا لفصل المجموعات السكانية الفرعية المختلفة باستخدام اسطوانات استنساخ لفصل واحد مستعمرة الخلايا المشتقة. ويمكن عندئذ الخلايا المشتقة من المستعمرات واحد يكون مثقف وتقييمها بشكل منفصل.
Protocol
Discussion
هذا البروتوكول يصف كيفية عزل وإثراء MSCS. وهو مدرج أيضا طريقة لفصل الخلايا مستعمرة واحدة مشتقة. هناك العديد من الخطوات التي تعتبر مهمة للفصل العزلة ، والإثراء ، ومستعمرة ناجحة. أثناء القيام العزلة خلية من الفئران ، فمن المستحسن لتصفية من خلال مصفاة خلية أو شبكة النايلو…
Acknowledgements
وأيد العمل في جزء من المعهد الوطني للصحة (R01GM079688 ، R21RR024439 وR21GM075838) ، المؤسسة الوطنية للعلوم (CBET 0941055) ، ومؤسسة جامعة ولاية ميشيغان.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | ||
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | ||
| Cell strainer | BD Bioscience | 352350 | ||
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | ||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| BD Imagnet | BD Bioscience | 552311 | ||
| Biotin mouse IgG2a | BD Bioscience | 555572 | ||
| Biotin mouse IgG1 | BD Bioscience | 555747 | ||
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | ||
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | ||
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | ||
| BD Imag buffer | BD Bioscience | 552362 | ||
| Round-bottom tube | BD Bioscience | 352063 | ||
| Streptavidin particles | BD Bioscience | 557812 | ||
| SA-PE | R&D systems | F0040 | ||
| Cloning cylinder | Sigma | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
