Isolatie en Verrijking van Rat mesenchymale stamcellen (MSC's) en de scheiding van Single-kolonie Derived MSC's
Summary
Rat MSC's werden geïsoleerd uit dijbeen en dij-en vervolgens verrijkt door magnetische celsortering. Gesorteerde cellen werden bevestigd voor de expressie van de oppervlakte markers door flowcytometrie. Deze cellen werden ook gekweekt in klonale dichtheid aan enkele kolonies vormen en vervolgens deze kolonies werden van elkaar gescheiden door het klonen van cilinders.
Abstract
MSC's zijn een populatie van volwassen stamcellen, dat is een veelbelovende bron voor therapeutische toepassingen. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd uit het beenmerg en kan gemakkelijk worden gescheiden van de hematopoietische stamcellen (HSC's) als gevolg van hun plastic therapietrouw. Dit protocol wordt beschreven hoe u MSC's te isoleren van de rat dijbeen en dij. De geïsoleerde cellen werden verder verrijkt tegen twee MSC oppervlakte markers CD54 en CD90 door magnetische celsortering. Uitdrukking van oppervlakte markers CD54 en CD90 werden vervolgens bevestigd door flowcytometrie-analyse. HSC marker CD45 was ook opgenomen om te controleren of de gesorteerde MSC's waren uitgeput van HSC. MSC's zijn van nature nogal heterogeen. Er zijn subpopulaties van cellen die verschillende vormen, proliferatie en differentiatie mogelijkheden hebben. Deze subpopulaties alle drukken van de bekende MSC markers en geen unieke marker is nog niet geïdentificeerd voor de verschillende subpopulaties. Daarom wordt een alternatieve benadering te scheiden van de verschillende subpopulaties met behulp van het klonen van cilinders te scheiden van single-kolonie afgeleide cellen. De cellen, afkomstig van de single-kolonies kunnen vervolgens worden gekweekt en afzonderlijk geëvalueerd.
Protocol
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe te isoleren en te verrijken MSC's. Een methode om de single-kolonie afgeleide cellen apart is ook opgenomen. Er zijn verschillende stappen die belangrijk zijn voor een succesvolle isolatie, verrijking en kolonie scheiding. Terwijl het doen van celisolatie van rat, is het raadzaam te filteren door middel van een cel zeef of een steriele nylon mesh van vergelijkbare grootte om zich te ontdoen van de bloedstolsels en het bot puin. Na de beplating van de cellen 's nachts, zullen veel dode…
Acknowledgements
Het werk werd mede ondersteund door het National Institute of Health (R01GM079688, R21RR024439, en R21GM075838), National Science Foundation (cbet 0.941.055) en de MSU Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | ||
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | ||
| Cell strainer | BD Bioscience | 352350 | ||
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | ||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| BD Imagnet | BD Bioscience | 552311 | ||
| Biotin mouse IgG2a | BD Bioscience | 555572 | ||
| Biotin mouse IgG1 | BD Bioscience | 555747 | ||
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | ||
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | ||
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | ||
| BD Imag buffer | BD Bioscience | 552362 | ||
| Round-bottom tube | BD Bioscience | 352063 | ||
| Streptavidin particles | BD Bioscience | 557812 | ||
| SA-PE | R&D systems | F0040 | ||
| Cloning cylinder | Sigma | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
