Isolierung und Anreicherung von Rat mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und Separation von Single-Kolonie Derived MSCs
Summary
Rat MSCs wurden aus Oberschenkel-und Unterschenkelknochen isoliert und dann durch magnetische Zellsortierung angereichert. Sortiert Zellen wurden für die Expression der Oberflächenmarker durchflusszytometrisch bestätigt. Diese Zellen wurden auch bei klonaler Dichte kultiviert werden, um einzelne Kolonien bilden, und dann dieser Kolonien wurden durch Klonen Zylinder getrennt.
Abstract
MSCs sind eine Population von adulten Stammzellen, die eine vielversprechende Quelle für therapeutische Anwendungen geeignet ist. Diese Zellen können aus dem Knochenmark isoliert werden und lässt sich leicht aus den hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) aufgrund ihrer plastischen Einhaltung getrennt werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie MSCs aus Ratten-Oberschenkel-und Unterschenkelknochen zu isolieren. Die isolierten Zellen wurden weiter gegen zwei MSCs Oberflächenmarker CD54 und CD90 durch magnetische Zellsortierung angereichert. Expression der Oberflächenmarker CD54 und CD90 wurden dann mittels Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt. HSC CD45 wurde ebenfalls enthalten, um zu überprüfen, ob die sortierten MSCs von HSK aufgebraucht waren. MSCs sind natürlich sehr heterogen. Es gibt Subpopulationen von Zellen, die verschiedenen Formen, Proliferation und Differenzierung Fähigkeiten haben. Diese Subpopulationen alle exprimieren den bekannten MSC-Marker und keine eindeutige Marker noch für die verschiedenen Subpopulationen identifiziert worden. Daher ist ein alternativer Ansatz zur Abtrennung der verschiedenen Subpopulationen mit Klonzylinder zu trennen Single-Kolonie abgeleiteten Zellen. Die Zellen aus dem Single-Kolonien abgeleitet werden dann kultiviert und getrennt ausgewertet.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie zu isolieren und zu bereichern MSCs. Eine Methode, um die Single-Kolonie abgeleiteten Zellen trennen, ist ebenfalls integriert. Es gibt mehrere Schritte, die wichtig sind für eine erfolgreiche Isolierung, Anreicherung und Trennung Kolonie. Währenddessen Zelle isoliert von Ratten, empfiehlt es sich, durch eine Zelle Sieb oder eine sterile Nylon-Mesh von ähnlicher Größe, um loszuwerden, das Blut gerinnt und Knochendebris Filter. Nach Ausplattieren der Zellen über Nacht werden viele t…
Acknowledgements
Die Arbeit wurde teilweise durch National Institute of Health (R01GM079688, R21RR024439 und R21GM075838), National Science Foundation (CBET 0941055) und der MSU-Stiftung unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | ||
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | ||
| Cell strainer | BD Bioscience | 352350 | ||
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | ||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| BD Imagnet | BD Bioscience | 552311 | ||
| Biotin mouse IgG2a | BD Bioscience | 555572 | ||
| Biotin mouse IgG1 | BD Bioscience | 555747 | ||
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | ||
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | ||
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | ||
| BD Imag buffer | BD Bioscience | 552362 | ||
| Round-bottom tube | BD Bioscience | 352063 | ||
| Streptavidin particles | BD Bioscience | 557812 | ||
| SA-PE | R&D systems | F0040 | ||
| Cloning cylinder | Sigma | C2059 |
References
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