בידוד והעשרה של תאים עכברוש mesenchymal גזע (MSCs) והפרדה של המושבה, סינגל נגזר MSCs
Summary
עכברוש MSCs נותקו מן עצמות הירך לבין tibias והעשירו מכן על ידי מיון התא מגנטי. תאים ממוין אושרו עבור ביטוי של סמני פני השטח על ידי cytometry הזרימה. תאים אלה בתרבית גם בצפיפות משובטים כדי ליצור מושבות אחת ואז מושבות אלה היו מופרדים על ידי שכפול צילינדרים.
Abstract
MSCs הם אוכלוסייה של בתאי גזע בוגרים, כי הוא מקור מבטיח עבור יישומים רפואיים. תאים אלה יכולים להיות מבודדים במח העצם ניתן להפריד בקלות מתאי גזע hematopoietic (HSCs) בשל הדבקות הפלסטיק שלהם. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד MSCs עצמות הירך של חולדות tibias. התאים היו מבודדים מועשר נוספת נגד שני סמנים MSCs משטח CD54 ו – CD90 על ידי מיון התא מגנטי. הביטוי של סמנים משטח CD54 ו CD90 אושרו אז על ידי ניתוח cytometry הזרימה. HSC סמן CD45 נכלל גם כדי לבדוק אם MSCs מיון היו מתרוקנים של HSCs. MSCs באופן טבעי הטרוגני למדי. יש subpopulations של תאים בעלי צורות שונות, ריבוי ויכולות בידול. Subpopulations כל אלה מבטאים את סמנים ידועים MSCs ואין סמן ייחודי שטרם זוהו עבור subpopulations שונים. לכן, גישה חלופית להפריד את subpopulations שונים היא באמצעות צילינדרים שיבוט להפריד את התאים שמקורם המושבה יחיד. התאים שמקורם יחיד מושבות אז יכול להיות מתורבת והערכה בנפרד.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד ולהעשיר MSCs. שיטה להפריד את המושבה חד תאים שמקורם היא גם Incorporated. ישנם כמה צעדים חשובים עבור הפרדה, בידוד העשרה המושבה מוצלח. אמנם עושה את תא הבידוד מן החולדה, מומלץ לסנן דרך מסננת או תא רשת ניילון סטריליים בגודל דומה להיפטר של קרישי דם ושברים …
Acknowledgements
העבודה נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01GM079688, R21RR024439 ו R21GM075838), הקרן הלאומית למדע (CBET 0941055), וקרן MSU.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | ||
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | ||
| Cell strainer | BD Bioscience | 352350 | ||
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | ||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| BD Imagnet | BD Bioscience | 552311 | ||
| Biotin mouse IgG2a | BD Bioscience | 555572 | ||
| Biotin mouse IgG1 | BD Bioscience | 555747 | ||
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | ||
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | ||
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | ||
| BD Imag buffer | BD Bioscience | 552362 | ||
| Round-bottom tube | BD Bioscience | 352063 | ||
| Streptavidin particles | BD Bioscience | 557812 | ||
| SA-PE | R&D systems | F0040 | ||
| Cloning cylinder | Sigma | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
