Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs
Summary
Rat CTMs foram isoladas do fémur ea tíbia e então enriquecida por separação de células magnéticas. Células classificadas foram confirmados para a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo. Estas células também foram cultivadas na densidade clonal para formar colônias individuais e, em seguida essas colônias foram separados por cilindros de clonagem.
Abstract
MSCs são uma população de células-tronco adultas, que é uma fonte promissora para aplicações terapêuticas. Estas células podem ser isoladas a partir da medula óssea e podem ser facilmente separadas as células-tronco hematopoéticas (HSCs), devido à sua adesão plástico. Este protocolo descreve como isolar as CTMs do fémur ea tíbia de ratos. As células foram isoladas enriquecido contra dois marcadores de superfície CD54 e CD90 MSCs por separação de células magnéticas. Expressão de marcadores de superfície CD54 e CD90 foram então confirmadas por análise de citometria de fluxo. HSC marcador CD45 também foi incluído para verificar se as CTMs foram classificadas esgotado de HSCs. MSCs são naturalmente bastante heterogênea. Existem subpopulações de células que têm formas diferentes de proliferação, diferenciação e habilidades. Estas subpopulações todos expressam os marcadores conhecidos MSCs e nenhum marcador único ainda não foi identificado para o sub-populações diferentes. Portanto, uma abordagem alternativa para separar as diferentes subpopulações está usando cilindros de clonagem para separar as colônias de células derivadas única. As células derivadas de colônias de um único podem ser cultivadas e avaliados separadamente.
Protocol
Discussion
Este protocolo descreve como isolar e enriquecer MSCs. Um método para separar as células-colônia única derivada é também incorporada. Há várias etapas que são importantes para uma separação de enriquecimento, isolamento e colônia de sucesso. Ao fazer o isolamento de células de rato, recomenda-se filtro através de um filtro de célula ou uma malha de nylon estéril de tamanho similar para se livrar dos coágulos de sangue e restos de ossos. Após o plaqueamento das células durante a noite, muitas células …
Acknowledgements
O trabalho foi suportado em parte pelo National Institute of Health (R01GM079688, R21RR024439 e R21GM075838), National Science Foundation (CBET 0.941.055), ea Fundação MSU.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | ||
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | ||
| Cell strainer | BD Bioscience | 352350 | ||
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | ||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| BD Imagnet | BD Bioscience | 552311 | ||
| Biotin mouse IgG2a | BD Bioscience | 555572 | ||
| Biotin mouse IgG1 | BD Bioscience | 555747 | ||
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | ||
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | ||
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | ||
| BD Imag buffer | BD Bioscience | 552362 | ||
| Round-bottom tube | BD Bioscience | 352063 | ||
| Streptavidin particles | BD Bioscience | 557812 | ||
| SA-PE | R&D systems | F0040 | ||
| Cloning cylinder | Sigma | C2059 |
References
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