Isolering och anrikning av Rat mesenkymala stamceller (MSC) och separation av Single-koloni Derived MSC
Summary
Rat MSC var isolerade från lårben och skenben och sedan berikats av magnetiska cell sortering. Sorterade celler bekräftades för uttrycket av yta markörer med flödescytometri. Dessa celler har även odlade på klonal täthet bilda enstaka kolonier och sedan dessa kolonier var åtskilda av kloning cylindrar.
Abstract
MSC är en population av adulta stamceller som är en lovande källa för terapeutiska tillämpningar. Dessa celler kan isoleras från benmärgen och kan lätt skiljas från hematopoetiska stamceller (HSCs) på grund av deras plast följsamhet. Detta protokoll beskriver hur man isolera MSC från råtta lårben och skenben. Den isolerade celler var ytterligare berikas mot två MSC ytan markörer CD54 och CD90 av magnetiska cell sortering. Redovisning av ytan markörer CD54 och CD90 har sedan bekräftats genom flödescytometri analys. HSC markör CD45 ingick också att kontrollera om det sorterade MSC var uttömda av HSCs. MSC är naturligtvis mycket heterogena. Det finns subpopulationer av celler som har olika former, spridning och förmågor differentiering. Dessa delpopulationer uttrycka alla de kända MSC markörer och ingen unik markör har ännu fastställts för de olika subpopulationer. Därför är en alternativ metod att skilja ut de olika subpopulationer med hjälp av kloning cylindrar att skilja ut en enda koloni härstammar celler. De celler som härrör från engångs-kolonierna kan sedan odlas och utvärderas separat.
Protocol
Discussion
Detta protokoll beskriver hur man isolera och berika MSC. En metod att separera enda kolonin härstammar celler är också införlivas. Det finns flera steg som är viktiga för en lyckad isolering, anrikning och koloni separation. Medan du gör celler isolerade från råtta, rekommenderas att filtrera genom en cell sil eller en steril nylonmesh av liknande storlek för att bli av blodproppar och ben skräp. Efter förkromning cellerna natten kommer många döda celler vara flytande i det mediet och döda celler avlägs…
Acknowledgements
Arbetet stöddes delvis av National Institute of Health (R01GM079688, R21RR024439 och R21GM075838), National Science Foundation (CBET 0.941.055) och MSU-stiftelsen.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | ||
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | ||
| Cell strainer | BD Bioscience | 352350 | ||
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | ||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| BD Imagnet | BD Bioscience | 552311 | ||
| Biotin mouse IgG2a | BD Bioscience | 555572 | ||
| Biotin mouse IgG1 | BD Bioscience | 555747 | ||
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | ||
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | ||
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | ||
| BD Imag buffer | BD Bioscience | 552362 | ||
| Round-bottom tube | BD Bioscience | 352063 | ||
| Streptavidin particles | BD Bioscience | 557812 | ||
| SA-PE | R&D systems | F0040 | ||
| Cloning cylinder | Sigma | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
