L'isolamento e l'arricchimento delle cellule staminali mesenchimali di ratto (MSC) e la separazione dei Single-colonia di cellule staminali mesenchimali derivate
Summary
Ratto MSC sono stati isolati da femori e delle tibie e poi arricchita da cell sorting magnetico. Cellule ordinati sono stati confermati per l'espressione di marcatori di superficie mediante citometria a flusso. Queste cellule sono state coltivate a densità clonale a formare singole colonie e poi queste colonie erano separate da cilindri di clonazione.
Abstract
Le MSC sono una popolazione di cellule staminali adulte che è una fonte promettente per applicazioni terapeutiche. Queste cellule possono essere isolate dal midollo osseo e può essere facilmente separato dalle cellule staminali ematopoietiche (HSC) a causa della loro adesione plastica. Questo protocollo descrive come isolare cellule staminali mesenchimali di topo femori e tibie. Le cellule isolate sono state ulteriormente arricchite contro due marcatori di superficie CD54 e CD90 MSC ordinando cellula magnetica. Espressione di marcatori di superficie CD54 e CD90 sono stati poi confermati da analisi di citometria a flusso. HSC marcatore CD45 è stato incluso anche per verificare se l'ordine MSCs erano impoverito di cellule staminali. MSC sono naturalmente molto eterogenei. Ci sono sottopopolazioni di cellule che hanno forme diverse, la proliferazione e le capacità di differenziazione. Queste sottopopolazioni tutti esprimono il marker noto MSC e nessun indicatore unico è stato ancora identificato per le diverse sottopopolazioni. Pertanto, un approccio alternativo per separare le diverse sottopopolazioni utilizza bombole di clonazione per separare le singole cellule derivate colonia. Le cellule derivate dal singolo colonie possono essere colti e valutati separatamente.
Protocol
Discussion
Questo protocollo descrive come isolare ed arricchire MSC. Un metodo per separare la singola colonia di cellule derivate anche incorporato. Ci sono diversi passaggi che sono importanti per una separazione efficace isolamento, l'arricchimento e la colonia. Mentre fate isolamento delle cellule di ratto, si consiglia di filtrare attraverso un colino cellulare o una maglia di nylon sterili di dimensioni simili a sbarazzarsi dei coaguli di sangue e frammenti ossei. Dopo placcatura le cellule durante la notte, molte cellu…
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institute of Health (R01GM079688, R21RR024439 e R21GM075838), National Science Foundation (cbet 0.941.055), e la Fondazione MSU.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | ||
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | ||
| Cell strainer | BD Bioscience | 352350 | ||
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | ||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| BD Imagnet | BD Bioscience | 552311 | ||
| Biotin mouse IgG2a | BD Bioscience | 555572 | ||
| Biotin mouse IgG1 | BD Bioscience | 555747 | ||
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | ||
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | ||
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | ||
| BD Imag buffer | BD Bioscience | 552362 | ||
| Round-bottom tube | BD Bioscience | 352063 | ||
| Streptavidin particles | BD Bioscience | 557812 | ||
| SA-PE | R&D systems | F0040 | ||
| Cloning cylinder | Sigma | C2059 |
References
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