分离和富集大鼠间质干细胞（MSCS）及衍生的干细胞分离单细胞集落
Summary
大鼠MSCs从股骨和胫骨分离，然后通过磁性细胞分选富集。排序细胞被证实为流式细胞仪检测表面标志物表达。这些细胞克隆密度培养，形成单菌落，然后这些菌落克隆气瓶分开。
Abstract
干细胞是一个成人干细胞的人口，这是一个治疗应用前途源。这些细胞可以从骨髓中分离，可以很容易地从造血干细胞（HSCs）由于塑料坚持分开。此协议介绍了如何从大鼠股骨和胫骨的干细胞分离。分离出的细胞对两个干细胞表面标志物CD54和磁性细胞分选CD90的进一步丰富。表面标志物CD54和CD90的表达，然后通过流式细胞仪分析证实。 HSC的标记CD45的也包括在内，以检查是否排序干细胞，造血干细胞耗尽。干细胞是自然相当异构。有不同的形状，增殖和分化能力的细胞亚群。所有这些亚群表达已知的干细胞标记，并没有独特的标记尚未确定不同的亚群。因此，分离出不同的亚群的一种替代方法是使用克隆气瓶分离出单细胞集落来源的细胞。然后可以从单一的殖民地所得的细胞培养和单独评价。
Protocol
1。大鼠MSCs的分离从6-8周龄只Sprague – Dawley雌性大鼠如前所述1，2间质干细胞分离。隔离的MSCs能坚持到塑料表面，并轻松地扩展在体外培养。 动物被放入一个麻醉室，麻醉，大约5分钟。在麻醉，观察闪烁，呼吸和运动活动的速度。立即从腔中取出的动物后，停止电机活动，成为罕见的闪烁速率。 打下的动物，一个操作站上颈椎脱位并杀死动物。切断从?…
Discussion
本协议描述了如何隔离和丰富的MSCs。一个分开的单细胞集落来源的细胞的方法也纳入其中。有几个步骤，是一个成功的分离，浓缩和殖民地分离的重要。虽然从大鼠细胞分离，这是建议通过细胞过滤器或类似大小的无菌尼龙网，清除血块和骨碎片的过滤器。电镀后的细胞在一夜之间，许多死细胞，将浮在中期和去除死细胞更换新鲜培养基，这应有助于贴壁细胞的生长。
磁性?…
Acknowledgements
这项工作是支持部分由国立卫生研究院（R01GM079688，R21RR024439，R21GM075838），美国国家科学基金会（CBET 0941055）和密歇根州立大学基金会。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | ||
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | ||
| Cell strainer | BD Bioscience | 352350 | ||
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | ||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| BD Imagnet | BD Bioscience | 552311 | ||
| Biotin mouse IgG2a | BD Bioscience | 555572 | ||
| Biotin mouse IgG1 | BD Bioscience | 555747 | ||
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | ||
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | ||
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | ||
| BD Imag buffer | BD Bioscience | 552362 | ||
| Round-bottom tube | BD Bioscience | 352063 | ||
| Streptavidin particles | BD Bioscience | 557812 | ||
| SA-PE | R&D systems | F0040 | ||
| Cloning cylinder | Sigma | C2059 |
References
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Citer Cet Article
Zhang, L., Chan, C. Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs. J. Vis. Exp. (37), e1852, doi:10.3791/1852 (2010).