İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma
Summary
Rat MKH, femur ve tibiaları izole edilmiş ve daha sonra manyetik hücre sıralama ile zenginleştirilmiş. Sıralama hücreler flow sitometri ile yüzey belirteçlerinin ifade teyit edildi. Bu hücreler de klonal yoğunluğu tek koloniler oluşturmak için kültüre edildi ve daha sonra bu kolonilerin klonlama silindir ile ayrıldı.
Abstract
MKH, yetişkin kök hücrelerin tedavi edici uygulamalar için umut verici bir kaynak bir nüfus vardır. Bu hücreler, kemik iliğinden izole edilebilir ve plastik bağlılık nedeniyle hematopoietik kök hücreler (HKH'lerin) kolaylıkla ayrılabilir. Bu protokol, sıçan femur ve tibiaları MKH izole etmek için nasıl açıklamaktadır. Izole hücreler manyetik hücre sıralayarak iki MKH yüzey belirteçleri CD54 ve CD90 karşı daha da zenginleştirilmiş. CD54 ve CD90 yüzey belirteçleri İfade sonra akış sitometri analizi ile teyit edildi. HSC işaretleyici CD45 sıralaması MKH HKH'lerin tüketilmiş olup olmadığını kontrol etmek için de yer aldı. MKH doğal olarak oldukça heterojen. Farklı şekiller, proliferasyon ve farklılaşma yetenekleri hücrelerin alt popülasyonlar vardır. Bu alt popülasyonlar, bilinen tüm MKH belirteçlerinin ifade ve farklı alt popülasyonlar için hiçbir benzersiz marker henüz tespit edilmiştir. Bu nedenle, farklı alt popülasyonlar ayırmak için alternatif bir yaklaşım tek koloni elde edilen hücreler ayrı klonlama silindir kullanıyor. Tek koloniler elde edilen hücreler daha sonra kültür ve ayrı olarak değerlendirilir.
Protocol
Discussion
Bu protokol, izole etmek ve zenginleştirmek MKH anlatılmaktadır. Tek koloni elde edilen hücreleri ayırmak için bir yöntem de dahil edilmiştir. Başarılı bir izolasyon, zenginleştirme ve koloni ayrımı için önemli olan birkaç adım vardır. Hücre izolasyonu sıçan yaparken, bir hücre süzgeç ya da kan pıhtılaşması ve kemik enkaz kurtulmak için benzer büyüklükte bir steril naylon örgü süzülmeye tavsiye edilir. Gecede hücreleri kaplama sonra, birçok ölü hücreleri orta yüzen olacak ve ö…
Acknowledgements
Çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (R01GM079688, R21RR024439 ve R21GM075838), Ulusal Bilim Vakfı (CBET 0.941.055) ve Mimar Sinan Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | ||
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | ||
| Cell strainer | BD Bioscience | 352350 | ||
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | ||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| BD Imagnet | BD Bioscience | 552311 | ||
| Biotin mouse IgG2a | BD Bioscience | 555572 | ||
| Biotin mouse IgG1 | BD Bioscience | 555747 | ||
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | ||
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | ||
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | ||
| BD Imag buffer | BD Bioscience | 552362 | ||
| Round-bottom tube | BD Bioscience | 352063 | ||
| Streptavidin particles | BD Bioscience | 557812 | ||
| SA-PE | R&D systems | F0040 | ||
| Cloning cylinder | Sigma | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
