Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità
Summary
La cellula permeabile reticolante DSP [dithiobis-(succinimidile propionato)] stabilizza le interazioni transienti e labile<em> In vivo</em>, Che consente loro isolamento utilizzando rigorosi tecniche di purificazione di proteine complesse. Qui vi presentiamo una tecnica per la reticolazione cellule in coltura seguita da isolamento di complessi proteici da immunoprecipitazione.
Abstract
La natura dinamica di macchine cellulare è spesso costruito sulle associazioni di proteine transitori e / o debole. Queste interazioni bassa affinità preclude metodi rigorosi per l'isolamento e l'identificazione di reti di proteine intorno ad una proteina di interesse. L'uso di reticolanti chimici permette la stabilizzazione selettiva delle interazioni labili, aggirando così le limitazioni biochimiche per la purificazione. Qui vi presentiamo un protocollo suscettibile di cellule in coltura che utilizza un reticolante homobifunctional con un braccio distanziatore di 12 Å, dithiobis-(succinimidile propionato) (DSP). DSP è scissa dalla riduzione di un legame disolfuro presenti nella molecola. Cross-linking in combinazione con la cromatografia di immunoaffinità di proteine di interesse con perline magnetiche permette l'isolamento di complessi proteici che altrimenti non avrebbe resistere purificazione. Questo protocollo è compatibile con le normali tecniche di Western Blot e può essere scalata per l'identificazione delle proteine mediante spettrometria di massa 1.
Stephanie A. Zlatic e Pearl V. Ryder contribuito in maniera uguale a questo lavoro.
Protocol
Discussion
DSP, una membrana permeabile, reticolante chimicamente riducibili con un braccio distanziatore di 12 A viene utilizzato per stabilizzare le interazioni proteina transitoria 1,2,3,4. Qui abbiamo esemplificato questa strategia con il complesso adattatore AP-3 un complesso proteina solubile che riconosce e ordina proteine di membrana in vescicole da endosomi 5. AP-3 si lega selettivamente al trasportatore di zinco ZnT3 e la chinasi dei lipidi fosfatidilinositolo-4-chinasi di tipo II, ma non dei …
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health a VF (NS42599 e GM077569).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM | |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Scientific | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma | D2650 | ||
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma | T9284 | ||
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit | |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
References
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