Выделение лабильной Multi-белковые комплексы по В естественных условиях Контролируемые Сотовая сшивания и иммуно-магнитного аффинной хроматографии
Summary
Ячейки проницаемыми сшивателя DSP [дитиобис-(сукцинимидил пропионат)] стабилизирует переходных и лабильной взаимодействия<em> В естественных условиях</em>, Что позволяет их изоляции использованием строгих белковый комплекс методов очистки. Здесь мы представляем технику для сшивания клетки, выращенные в культуре с последующим выделением белковых комплексов, иммунопреципитацией.
Abstract
Динамичный характер клеточных механизмов часто построены на переходных и / или слабые ассоциации белка. Эти низкие взаимодействия близость исключает строгие методы выделения и идентификации белков сетей по всему белок. Использование химических сшивающих агентов позволяет селективной стабилизации лабильных взаимодействия, минуя биохимических ограничения для очистки. Здесь мы приводим протокол поддаются на клетки в культуре, которая использует homobifunctional сшивающий со спейсером руки 12 Å, дитиобис-(сукцинимидил proprionate) (DSP). DSP расщепляется снижение связь дисульфид присутствует в молекуле. Сшивка в сочетании с иммуноаффинной хроматографии белков интересов с магнитных гранул позволяет изолировать белковых комплексов, которые иначе не выдержат очистки. Этот протокол совместим с регулярными западных технологий пятном и она может быть расширены для идентификации белков методом масс-спектрометрии 1.
Стефани А. Zlatic и Перл В. Райдер способствовали в равной степени к этой работе.
Protocol
Discussion
DSP, мембраны проницаемыми, химически приводимым сшивающий со спейсером руки 12 Å используется для стабилизации переходных взаимодействий белков 1,2,3,4. Здесь примером этой стратегии с адаптером комплекса AP-3 растворимый комплекс белок, который распознает и сортирует мембранных бел…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья В. Ф. (NS42599 и GM077569).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM | |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Scientific | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma | D2650 | ||
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma | T9284 | ||
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit | |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
References
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate. J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).
- Xiang, C. C. Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling. Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).
- Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic. Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).
- Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery. J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).
- Salazar, G. The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation. Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).
- Trinkle-Mulcahy, L. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
