Optimierte Fibringel Bead Assay für das Studium der Angiogenese

Summary

Dieses Video zeigt das Protokoll eines in-vitro-Angiogenese-Assay, rekapituliert mehrere Stufen der Angiogenese. Zeitraffer-Bilder von Keimen, Lumenbildung, Verzweigung und Anastomose – die wichtigsten Merkmale der Angiogenese – gezeigt werden.

Abstract

Die Angiogenese ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, in dem, in Antwort auf angiogene Stimuli, neue Schiffe aus dem bestehenden Gefäßsystem geschaffen werden. Diese Schritte sind: Abbau der Basalmembran, die Proliferation und Migration (sprießen) von Endothelzellen (EC) in der extrazellulären Matrix, die Ausrichtung der EG zu Schnüren, Verzweigungen, Lumenbildung, Anastomose, und die Bildung einer neuen Basalmembran. Viele in-vitro-Assays wurden entwickelt, um diesen Prozess zu studieren, aber die meisten nur imitieren bestimmte Stadien der Angiogenese und morphologisch die Schiffe innerhalb des Assays oft nicht Schiffe in vivo ähneln. Basierend auf früheren Arbeiten von Nehls und Drenckhahn, haben wir ein in vitro-Angiogenese-Assay, der menschlichen Nabelvene EG und Fibroblasten nutzt optimiert. Dieses Modell rekapituliert alle wichtigen frühen Phasen der Angiogenese und, was wichtig ist, zeigen die Gefäße Patent interzellulären Lumen durch polarisiertes EG umgeben. EG werden auf Cytodex Mikroträger beschichtet und eingebettet in eine Fibrin-Gel. Fibroblasten sind auf der Oberseite des Gels, wo sie bieten notwendige lösliche Faktoren, die EG sprießen aus der Oberfläche der Kügelchen zu fördern geschichtet. Nach mehreren Tagen sind zahlreiche Schiffe zu, die leicht unter Phasen-Kontrast-und Zeitraffer-Mikroskopie beobachtet werden. Dieses Video zeigt die wichtigsten Schritte bei der Einrichtung dieser Kulturen.

Protocol

VORBEREITUNG CELLS Rufen Sie HUVEC und Fibroblasten in M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 Tage vor Sicken. Schalten Sie mittel-bis EGM-2 (Clonetics) am Tag vor Sicken für HUVEC und der Tag vor dem Einbetten für Fibroblasten. Eine Konzentration von ~ 400 HUVEC pro Perle benötigt wird. 20.000 Fibroblasten pro Vertiefung erforderlich ist. COATING die Perlen mit HUVEC – Tag -1 Trypsinize HUVEC. Lassen Perlen absetzen (nicht z…

Discussion

Es gibt einen wachsenden Konsens, dass die dreidimensionale (3D) in vitro Angiogenese-Assays ein Modell, das viel näher an der tatsächlichen Umgebung in vivo als erreicht mit Hilfe von 2D Kulturen anbieten. Es ist offensichtlich, dass überlegene 3D-Systeme sollten reproduzierbar sein, und in der Lage sein, mehrere der wichtigsten Schritte der Angiogenese zu imitieren. Während mehrerer früherer 3D-Assays entwickelt worden, viele von ihnen entweder schwer zu erhalten mikrovaskulären Zellen, oder nur zu rekapitulieren einige der Etappen….

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Cytodex-3 Beads	Reagent	Amersham Pharmacia	17-0485-01	10 g/bottle. 1. 0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker. 2. Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL). 3. Discard the PBS and replace with fresh PBS: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL 4. Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote). 5. Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115C. 6. Store it at 4C.
Aprotinin	Reagent	Sigma	A-1153	10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C.
Fibrinogen Type I	Reagent	Sigma	F-8630	1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBS Note clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex. Sterile filter through 0.22 um
Thrombin	Reagent	Sigma	T-3399	22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C.