אופטימליים הפיברין ג'ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה
Summary
וידאו זה מדגים את פרוטוקול ב assay אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים שונים של אנגיוגנזה. זמן לשגות תמונות של הנבטה, היווצרות לומן, הסתעפות ו השקה – התכונות העיקריות של אנגיוגנזה – מוצגים.
Abstract
אנגיוגנזה היא תהליך מורכב רב שלבי, שבו, בתגובה לגירויים angiogenic, כלי חדש נוצרות vasculature הקיים. צעדים אלה כוללים: ירידה של התפשטות קרום, מרתף והגירה (נביטה) של בתאי האנדותל (EC) לתוך המטריצה תאיים, יישור של EC לתוך מיתרי, מסתעפת, היווצרות לומן, השקה, ועל היווצרות קרום מרתף חדשה. רבים מבחני חוץ גופית פותחו כדי ללמוד את התהליך הזה, אבל רוב לחקות רק בשלבים מסוימים של אנגיוגנזה, ואת מורפולוגית כלי בתוך מבחני לעתים קרובות לא דומים כלי in vivo. בהתבסס על עבודה קודמת על ידי Nehls ו Drenckhahn, יש לנו אופטימיזציה ב assay אנגיוגנזה במבחנה אשר מנצל האדם וריד הטבור EC ו fibroblasts. זה המודל משחזר את כל השלבים המוקדמים המפתח של אנגיוגנזה, חשוב, כלי התצוגה לומן אינטר פטנט מוקף EC מקוטב. EC הם מצופים על microcarriers cytodex ומוטבעים לתוך ג'ל הפיברין. Fibroblasts הם שכבות על גבי ג'ל שבו הם מספקים גורמים מסיסים הכרחי לקדם EC הנבטה מפני השטח של החרוזים. אחרי כמה ימים, כלי רבים נוכחים כי ניתן בקלות לצפות תחת ניגוד פאזה זמן לשגות מיקרוסקופ. וידאו זה מדגים את השלבים העיקריים בהקמת אלה תרבויות.
Protocol
Discussion
קיימת הסכמה גוברת תלת ממדי (3D) ב מבחני חוץ גופית אנגיוגנזה להציע מודל אשר הרבה יותר לסביבה מאשר בפועל in vivo יכולה להיות מושגת באמצעות תרבויות 2D. ניכר כי מערכות 3D מעולה צריך להיות לשחזור, ולהיות מסוגלים לחקות כמה שלבים עיקריים של אנגיוגנזה. בעוד מספר מבחני 3D הקודם פותחו, רבים מהם גם …
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham Pharmacia | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1. 0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker. 2. Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL). 3. Discard the PBS and replace with fresh PBS: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL 4. Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote). 5. Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115C. 6. Store it at 4C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma | A-1153 | 10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma | F-8630 | 1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBS Note clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex. Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma | T-3399 | 22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
