Оптимизированная фибринового геля из бисера тест для изучения ангиогенеза
Summary
Это видео демонстрирует протокол в анализе ангиогенеза пробирке, что повторяет несколько стадий ангиогенеза. Покадровый изображения прорастания, просвет образования, ветвление и анастомоза – ключевые особенности ангиогенез – это показано на рисунке.
Abstract
Ангиогенез представляет собой сложный многоступенчатый процесс, в котором, в ответ на ангиогенных стимулы, новые суда создаются из существующих сосудов. Эти шаги включают в себя: деградации базальной мембраны, пролиферации и миграции (прорастание) эндотелиальных клеток (ЕК) в внеклеточного матрикса, выравнивания ЕС в шнуры, ветвящийся, просвет образования, анастомоза, и формирование новой базальной мембраны. Многие в пробирке тесты были разработаны для изучения этого процесса, но большинство лишь имитируют определенные этапы ангиогенеза, и морфологически судов в анализах часто не похожи на судах в естественных условиях. На основе более ранних работ Nehls и Drenckhahn, мы оптимизировали в пробирке ангиогенеза анализа, который использует пупочной вены человека ЕС и фибробластов. Эта модель повторяет все ключевые ранних стадий ангиогенеза и, что немаловажно, судов дисплей патент межклеточных люмен окруженной поляризованной ЕС. ЕС покрыты на микроносителях cytodex и встроенных в гель фибрина. Фибробласты слой поверх геля, где они обеспечивают необходимый растворимых факторов, которые способствуют прорастанию ЕС с поверхности бусины. После нескольких дней, многочисленные суда присутствуют, которые можно легко наблюдается при фазово-контрастной и покадровой микроскопии. Это видео демонстрирует основные этапы в создании этих культур.
Protocol
Discussion
Существует растущий консенсус, что трехмерная (3D) в анализах пробирке ангиогенеза предлагаем модель, которая гораздо ближе к реальной среде, чем в естественных условиях можно добиться, используя 2D культур. Очевидно, что превосходное 3D-системы должны быть воспроизводимы, и будут способны имитиров?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham Pharmacia | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1. 0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker. 2. Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL). 3. Discard the PBS and replace with fresh PBS: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL 4. Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote). 5. Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115C. 6. Store it at 4C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma | A-1153 | 10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma | F-8630 | 1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBS Note clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex. Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma | T-3399 | 22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
