Экспрессия рекомбинантных белков в метилотрофных дрожжей Pichia pastoris</em
Summary
Протокол описывает экспрессии белка использованием метилотрофных дрожжей<em> Pichia pastoris</em>. Подготовка electrocompetent дрожжевых клеток, превращение вектора с геном интерес в<em> П. pastoris</em> И очистки ДНК дрожжей, также выполняются. Вестерн-блот анализе и очистки белков построить последних шагов в этом протоколе экспрессии белка.
Abstract
Экспрессии белка в микробной эукариотических pastoris Pichia хозяин предлагает возможность генерировать большое количество рекомбинантного белка в быстрой и простой в использовании системы экспрессии.
Как одноклеточных микроорганизмов P. pastoris легко манипулировать и быстро растет на недорогих средств массовой информации при высокой плотности клеток. Будучи эукариот, П. pastoris способен выполнять многие из пост-трансляционной модификации выполняются выше эукариотических клеток и получены рекомбинантные белки проходят сворачивания белка, протеолитической обработки, формирование дисульфидных связей и гликозилирования [1].
Как метилотрофных дрожжей P. pastoris способна метаболизм метанола в качестве единственного источника углерода. Сильный промотор для алкоголя оксидазы, AOX1, жестко регулируется и индуцированной метанола и его используют для выражения гена. Соответственно, выражение чужеродный белок может быть вызвано добавлением метанола в среде роста [2, 3].
Другим важным преимуществом является выделение рекомбинантного белка в питательной среде, используя сигнал последовательности целевой чужеродный белок в секреторный путь pastoris П.. Только с низким уровнем эндогенного белка выделяется в СМИ дрожжей себя и без добавления белков в средствах массовой информации, чужеродного белка строит большинством голосов от общего белка в средних и облегчает следующие этапы очистки белков [3, 4].
Вектор, используемый здесь (pPICZαA) содержит промотор для AOX1 жестко регулируется, метанол-индуцированной экспрессии гена интересов; α-фактора секреции сигнал для секреции рекомбинантного белка, ген Zeocin сопротивления для отбора в обоих E. палочки и Pichia и С-концевой пептид, содержащий с-Myc эпитопа и polyhistidine (6xHis) теги для обнаружения и очистки рекомбинантного белка. Мы также показываем, западные блот-анализ рекомбинантных белков с использованием специфических Anti-Myc-HRP антител признавая с-Myc эпитопа на родительском вектор.
Protocol
Discussion
Белки выражения с помощью метилотрофных дрожжей Pichia pastoris качестве хост-системы, описанной в этой протокола. Белок может быть секретируется в среду в зависимости от используемого клонирования вектор. Выделение рекомбинантного белка делает последующей очисткой легче. Тем не менее…
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Канадский фонд инноваций, знаний британской Колумбии Фонд развития и канадских институтов здравоохранения (CIHR) за поддержку этой работы. MT была поддержана общение с ТУЛА основу финансируемого Центром микробного разнообразия и эволюции (CMDE).
References
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).
- Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).
