Expression de protéines recombinantes dans le levure méthylotrophe</em

Summary

Le protocole décrit l'expression de protéines en utilisant la levure méthylotrophique. La préparation des cellules de levure électrocompétentes, la transformation du vecteur avec le gène d'intérêt dans P. pastoris Et la purification d'ADN de levure sont également effectués. Western blot et de purification des protéines construire les dernières étapes de ce protocole d'expression de protéines.

Abstract

L'expression des protéines microbiennes dans le pastoris hôte eucaryote Pichia offre la possibilité de générer de grandes quantités de protéine recombinante dans un système d'expression rapide et facile à utiliser.

En tant que P. unicellulaires microorganisme pastoris est facile à manipuler et se développe rapidement sur ​​un support peu coûteux à de fortes densités cellulaires. Être un eucaryote, P. pastoris est capable d'effectuer de nombreuses modifications post-traductionnelles effectuées par des cellules eucaryotes supérieures et les protéines recombinantes obtenues subissent le repliement des protéines, le traitement protéolytique, formation de ponts disulfures et de glycosylation [1].

Comme une levure méthylotrophe P. pastoris est capable de métaboliser le méthanol comme seule source de carbone. Le promoteur fort pour l'alcool oxydase, AOX1, est strictement réglementée et induite par le méthanol et il est utilisé pour l'expression du gène d'intérêt. En conséquence, l'expression de la protéine étrangère peut être induite par addition de méthanol au milieu de croissance [2, 3].

Un autre avantage important est la sécrétion de la protéine recombinante dans le milieu de croissance, en utilisant une séquence signal pour cibler la protéine étrangère à la voie de sécrétion de P. pastoris. Avec seulement un faible niveau de protéine endogène sécrétée à la presse par la levure elle-même et pas de protéines ajouté aux médias, une protéine hétérologue construit la majorité des protéines totales dans le milieu et facilite les étapes suivantes de purification des protéines [3, 4].

Le vecteur utilisé ici (pPICZαA) contient le promoteur pour AOX1 étroitement réglementé, le méthanol induit l'expression du gène d'intérêt, le signal de sécrétion du facteur α de la sécrétion de la protéine recombinante, un gène de résistance à la zéocine pour la sélection dans les deux E. coli et Pichia et un peptide C-terminal contenant l'épitope c-myc et une polyhistidine (6xHis) tag pour la détection et la purification d'une protéine recombinante. Nous montrons aussi une analyse Western blot de la protéine recombinante en utilisant les anticorps spécifiques anti-myc-HRP anticorps reconnaissant l'épitope c-myc sur le vecteur parent.

Protocol

L'expression de protéines recombinantes dans la levure Pichia pastoris méthylotrophes

Avant de commencer ce protocole, vous devez avoir votre gène d'intérêt cloné dans le châssis dans un p. vecteur parent pastoris et l'ont séquencé pour vérifier l'insertion correcte du gène d'intérêt dans le vecteur.

Etape I: Générer des cellules de levure électrocompétentes, la linéarisation de la construction et de transformation en P. pastoris

Pour cette étape, vous aurez besoin d'avoir les médias suivants et les plaques à portée de main:

• Plaques YPDS....

Discussion

L'expression des protéines à l'aide de la levure méthylotrophe Pichia pastoris comme un système hôte est décrite dans ce protocole. La protéine peut être sécrété dans le milieu en fonction du vecteur de clonage utilisé. La sécrétion de la protéine recombinante permet la purification ultérieure plus facile. Toutefois, les conditions indiquées peuvent être optimisés pour l'expression de différentes protéines et les changements dans les conditions et les délais d'expression peut entraîner des nivea.......