التعبير عن البروتينات المؤتلف في الخميرة Methylotrophic Pichia pastoris</em
Summary
بروتوكول يصف تعبير البروتين باستخدام الخميرة methylotrophic<em> Pichia pastoris</em>. إعداد electrocompetent خلايا الخميرة ، والتحول من ناقلات الجينات مع الاهتمام في<em> P. pastoris</emوتجرى أيضا> والخميرة تنقية الحمض النووي. الغربية لطخة تحليل وتنقية البروتين بناء الخطوات الأخيرة في هذا البروتين بروتوكول التعبير.
Abstract
بروتين تعبير في الميكروبية حقيقية النواة المضيفة pastoris Pichia توفر إمكانية توليد كميات عالية من البروتين المؤتلف في نظام التعبير سريع وسهل الاستخدام.
ك P. الكائنات الحية الدقيقة وحيدة الخلية pastoris من السهل التلاعب وتنمو بسرعة على وسائل الاعلام الرخيصة بكثافة عالية الخلية. كونه حقيقي النواة ، P. pastoris قادرة على تنفيذ العديد من التعديلات بعد متعدية التي تؤديها خلايا حقيقية النواة العالي والحصول على البروتينات المؤتلف الخضوع للطي البروتين ، وتجهيز بروتين ، ثاني كبريتيد السندات ، وتكوين ارتباط بالغليكوزيل [1].
ك P. الخميرة methylotrophic pastoris قادر على التأييض الميثانول كمصدر وحيد للكربون. وينظم بإحكام المروج قوية لأوكسيديز الكحول ، AOX1 ، والميثانول والناجمة عن استخدامه للتعبير عن الجينات في المصالح. تبعا لذلك ، يمكن أن يكون ذلك حافزا للتعبير عن البروتين الخارجية بإضافة الميثانول إلى وسط النمو [2 ، 3].
ميزة أخرى هامة هي إفراز بروتين المؤتلف في متوسطة النمو ، وذلك باستخدام تسلسل إشارة إلى استهداف بروتين الأجنبية إلى مسار إفرازية من pastoris P.. مع مستويات منخفضة من البروتين فقط يفرز الذاتية على وسائل الاعلام نفسها الخميرة والبروتينات لا تضاف إلى وسائل الإعلام ، وهو بروتين غيروي يبني غالبية البروتين الكلي في الأجلين المتوسط ويسهل الخطوات التالية لتنقية البروتين [3 ، 4].
الموجه المستخدمة هنا (pPICZαA) يحتوي على مروج AOX1 لتنظيم محكم التعبير الميثانول التي يسببها ، من الجينات في المصالح ؛ إشارة إفراز α عامل لإفراز البروتين المؤتلف ، والجينات المقاومة لاختيار Zeocin في كل من E. القولونية وPichia والببتيد C – المحطة تحتوي على حاتمة ج myc وpolyhistidine (6xHis) شعارا لكشف وتنقية البروتين المؤتلف. نعرض أيضا تحليل لطخة غربية من البروتين المؤتلف باستخدام محددة لمكافحة myc – HRP الضد الاعتراف حاتمة ج myc على ناقلات الأصل.
Protocol
Discussion
يوصف التعبير البروتين باستخدام الخميرة Pichia methylotrophic pastoris كنظام المضيف في هذا البروتوكول. يمكن أن يفرز هذا البروتين في المتوسط اعتمادا على ناقلات الاستنساخ المستخدمة. إفراز بروتين المؤتلف يجعل تنقية اللاحقة أسهل. ومع ذلك ، قد أظهرت الظروف أن يكون الأمثل ?…
Acknowledgements
نود أن نشكر المؤسسة الكندية للإبداع ، ومعارف كولومبيا البريطانية صندوق التنمية ، والمعاهد الكندية للأبحاث الصحية (CIHR) لدعم هذا العمل. وأيد طن متري من الزمالة من مركز تولا مؤسسة ممولة للتنوع وتطور الميكروبية (CMDE).
References
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).
- Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).
