Espressione di proteine ricombinanti nel lievito Methylotrophic Pichia pastoris</em
Summary
Il protocollo descrive l'espressione della proteina usando il lievito methylotrophic<em> Pichia pastoris</em>. La preparazione di cellule di lievito electrocompetent, la trasformazione del vettore con il gene di interesse in<em> P. pastoris</em> E di purificazione del DNA lievito sono anche eseguito. Western blot e la purificazione di proteine costruire gli ultimi passi in questo protocollo l'espressione della proteina.
Abstract
Espressione della proteina in Pichia pastoris microbica eucariotica ospitante offre la possibilità di generare elevate quantità di proteina ricombinante in un sistema di espressione veloce e facile da usare.
Come un microrganismo unicellulare P. pastoris è facile da manipolare e cresce rapidamente su un supporto economico a densità elevata delle cellule. Essendo un eucariote, P. pastoris è in grado di eseguire molte delle modificazioni post-traduzionali eseguiti dai maggiori cellule eucariotiche e le proteine ricombinanti ottenuti subiscono ripiegamento delle proteine, maturazione proteolitica, la formazione di legame disolfuro e glicosilazione [1].
Come un lievito P. methylotrophic pastoris è in grado di metabolizzare metanolo come unica fonte di carbonio. Il promotore forte per l'alcol ossidasi, AOX1, è strettamente regolato e indotta da metanolo ed è utilizzato per l'espressione del gene di interesse. Di conseguenza, l'espressione della proteina estranea può essere indotta con l'aggiunta di metanolo al mezzo di crescita [2, 3].
Un altro vantaggio importante è la secrezione della proteina ricombinante nel mezzo di crescita, utilizzando una sequenza segnale per indirizzare la proteina estranea al via secretoria di P. pastoris. Con solo i bassi livelli di proteina endogena secreta alla stampa dallo stesso lievito e senza proteine aggiunti ai media, una proteina eterologa costruisce la maggior parte delle proteine totali nel medio e facilita le seguenti fasi di purificazione proteica [3, 4].
Il vettore usato qui (pPICZαA) contiene il promotore per AOX1 strettamente regolamentati, metanolo-indotta espressione del gene di interesse, il fattore-α segnale di secrezione per la secrezione della proteina ricombinante, un gene di resistenza Zeocin per la selezione sia in E. coli e Pichia e un C-terminale del peptide contenente il c-myc e un epitopo (6xHis) tag polyhistidine per il rilevamento e la purificazione di una proteina ricombinante. Mostriamo anche l'analisi western blot della proteina ricombinante utilizzando lo specifico anti-myc HRP-anticorpo che riconosce il c-myc epitopo sul vettore genitore.
Protocol
Discussion
Espressione della proteina usando il methylotrophic Pichia pastoris lievito come sistema host è descritto in questo protocollo. La proteina può essere secreta nel mezzo a seconda del vettore di clonazione utilizzata. La secrezione della proteina ricombinante rende più facile la successiva purificazione. Tuttavia, le condizioni indicate possono essere ottimizzati per l'espressione di proteine diverse e cambiamenti nelle condizioni e tempi di espressione può portare a livelli di proteine maggi…
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l'innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Canadian Institutes of Health Research (CIHR) per sostenere questo lavoro. MT è stato sostenuto da una borsa di studio del Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution (CMDE).
References
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).
- Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).
