Expression av rekombinanta proteiner i Methylotrophic Jäst Pichia pastoris</em

Summary

Protokollet beskriver protein uttryck med methylotrophic jäst<em> Pichia pastoris</em>. Beredningen av electrocompetent jästceller, omvandling av vektorn med genen av intresse i<em> P. pastoris</em> Och jäst DNA-rening utförs också. Western blot analys och proteinrening bygga de sista stegen i denna protein expression protokoll.

Abstract

Protein uttryck i den mikrobiella eukaryota värd Pichia pastoris ger möjlighet att generera höga halter av rekombinant protein i ett snabbt och enkelt att använda uttryck system.

Som en encelliga mikroorganismer s. pastoris är lätt att manipulera och växer snabbt på billiga medier vid höga cell tätheter. Att vara en eukaryota, s. pastoris kan utföra många av post-translationella modifieringar som utförs av högre eukaryota celler och de erhållna rekombinanta proteiner genomgår proteinveckning, proteolytiska bearbetning, disulfid band bildas och glykosylering [1].

Som en methylotrophic jäst P. pastoris kan metaboliserande metanol som enda kolkälla. Den starka promotor för alkohol oxidas, AOX1, är hårt reglerad och induceras av metanol och det används för uttrycket av genen av intresse. Följaktligen kan uttrycket av den främmande protein sättas igång genom att lägga till metanol till odlingsmedium [2, 3].

En annan viktig fördel är utsöndring av rekombinant protein i odlingsmedium, med hjälp av en signal sekvens för att rikta främmande protein till Utsöndringsvägarna av P. pastoris. Med endast låga nivåer av endogent protein som utsöndras till media av jästen själv och utan tillsats av proteiner till media, bygger en heterologa proteiner majoriteten av det totala proteininnehållet på medellång och underlättar följande steg proteinrening [3, 4].

Den vektor som används här (pPICZαA) innehåller AOX1 promotor för hårt reglerad, metanol-inducerad uttryck av genen av intresse, det α-faktorn sekretion signal för sekretion av rekombinant protein, en Zeocin motstånd genen för val i både E. coli och Pichia och en C-terminal peptid som innehåller c-Myc epitopen och en polyhistidine (6xHis) tag för att upptäcka och rening av ett rekombinant protein. Vi visar även Western Blot analys av rekombinanta proteiner med hjälp av specifika anti-Myc-HRP antikropp erkänna c-Myc epitopen på den överordnade vektor.

Protocol

Expression av rekombinanta proteiner i methylotrophic jäst Pichia pastoris Innan du börjar detta protokoll bör du ha din genen av intresse klonas i ram i en P. vektor pastoris förälder och ha det sekvenserade att kontrollera om rätt att genen av intresse i Vector. Steg I: Generera electrocompetent jästceller, linjärisering av konstruktionen och omvandling till P. pastoris För detta steg behöve…

Discussion

Protein uttryck med methylotrophic pastoris jästen Pichia som ett värdsystem beskrivs i detta protokoll. Proteinet kan utsöndras i mediet beroende på vilken kloningsvektor. Utsöndring från rekombinant protein gör den efterföljande rening lättare. Kan dock visat villkor måste vara optimerade för uttryck av olika proteiner och förändringar i de villkor och tider uttryck kan resultera i ökad protein nivåer. Den vektor som används i detta protokoll har funktionen av en c-Myc epitop…