تطبيق أساليب حركية متوقف تدفق بالتحقيق في آلية عمل لإصلاح الحمض النووي من البروتين
Summary
MSH2 – Msh6 مسؤولة عن الشروع في إصلاح أخطاء النسخ المتماثل في الحمض النووي. هنا نقدم مقاربة حركية عابرة نحو فهم كيفية عمل هذا البروتين الحرجة. ويوضح التقرير توقف تدفق التجارب لقياس الحمض النووي ملزمة تقترن الكامنة والحركية أتباز MSH2 – Msh6 آلية العمل في إصلاح الحمض النووي.
Abstract
لا غنى عن التحليل الحركي عابرة لفهم طرق عمل الجزيئات البيولوجية ، لأن هذا النهج يعطي معلومات الآلية بما في ذلك تركيزات موقع نشط والثوابت الجوهرية التي تحكم سعر الدالة الجزيئات. في حالة من الإنزيمات ، على سبيل المثال ، وقياسات حالة عابرة أو المستقرة قبل تحديد وتوصيف الأحداث الفردية في مسار التفاعل ، بينما القياسات حالة ثابتة العائد فقط الكفاءة والنوعية الشاملة الحفاز. أحداث فردية مثل البروتين البروتين أو البروتين يجند – التفاعلات ومعدل الحد من التغييرات متعلق بتكوين غالبا ما تحدث في مقياس ميلي ثانية واحدة ، ويمكن قياسها بصورة مباشرة وتوقف تدفق الكيميائية إخماد أساليب التدفق. إعطاء إشارة ضوئية مثل مضان ، توقف تدفق بمثابة أداة قوية للتقدم والوصول إلى رد فعل من رصد الركيزة ملزم لاطلاق سراح المنتج والمحفز 1،2 دوران.
هنا ، نحن تقرير تطبيق وقف تدفق حركية للبحث في آلية عمل Msh6 – MSH2 ، وإصلاح الحمض النووي حقيقية النواة البروتين الذي يعترف الزوج قاعدة عدم التطابق والإدراج / حذف التكرار في الحمض النووي وإصلاح عدم تطابق إشارات (MMR) 3-5. وهو يفعل ذلك ، MSH2 – Msh6 يزيد من دقة تكرار الحمض النووي من ثلاثة أوامر من حجم (تردد يقلل من الخطأ ~ 10 -6 -9 قواعد to10) ، وبالتالي يساعد على الحفاظ على سلامة الجينوم. ليس من المستغرب أن يرتبط الإنسان المعيبة MSH2 – Msh6 الدالة مع سرطان القولون الوراثي غير المرجلات وسرطانات أخرى متفرقة 6-8. من أجل فهم آلية عمل هذا البروتين DNA الأيضية حرجة ، ونحن الذين يحققون في ديناميات MSH2 – Msh6 التفاعل مع الحمض النووي متطابقة ، فضلا عن النشاط الذي يغذي أتباز أفعالها في MMR. ويتم قياس الحمض النووي ملزمة بسرعة عن طريق خلط MSH2 – Msh6 مع الحمض النووي يحتوي على 2 – aminopurine (2 – CNN) fluorophore مجاور لG : T عدم تطابق ومراقبة الزيادة الناتجة في 2 – aminopurine مضان في الوقت الحقيقي. ويتم قياس الحمض النووي عن طريق خلط تفارق قبل تشكيل MSH2 – G Msh6 : T (2 – CNN) معقدة مع عدم تطابق الحمض النووي فخ غير المسماة وانخفاض الرصد في مضان بمرور الوقت 9. تقاس قبل مطرد حركية أتباز الدولة عن تغيير في مضان من 7 diethylamino – 3 – (((((2 – maleimidyl) الإيثيل) الأمينية) الكربونيل) الكومارين) البروتين المسمى الفوسفات تجليد (MDCC – PBP) على الفوسفات ملزم بي) نشرته Msh6 – MSH2 التالية المائي ATP 9،10.
وتكشف البيانات ملزمة السريع لMsh6 – G MSH2 إلى : عدم تطابق تي وتشكيل لG – MSH2 Msh6 طويلة الأمد : T المعقدة ، والتي تؤدي بدورها في قمع المائي وتحقيق الاستقرار للاعبي التنس المحترفين من البروتين في شكل محدد للاعبي التنس المحترفين . رد فعل حركية واضحة لتقديم دعم الفرضية القائلة بأن بطولة متجهة MSH2 – Msh6 إشارات إصلاح الحمض النووي على قاعدة ملزمة لزوج غير متطابقة في الحلزون المزدوج.
ساهم F. نوح Biro وتشاي جي لهذه الورقة على قدم المساواة.
Protocol
Discussion
على سبيل المثال لعدم تطابق الحمض النووي من البروتين ملزمة الموصوفة هنا يوضح قوة وفائدة أساليب حركية عابرة لدراسة آليات للجزيئات البيولوجية. شريطة توقف تدفق القياسات على مقياس دوران مرة واحدة أدلة لا لبس فيها للربط السريع ومحددة من MSH2 – Msh6 البروتين إلى زوج قاعدة متطا?…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل على جائزة التوظيف NSF (MMH) ، ومحمد باري غولدووتر منحة دراسية (FNB) ، وجائزة البحوث الجامعية ASBMB (CWD). ويعود الفضل في استنساخ للتعبير عن أكثر من PBP الدكتور مارتن ويب (MRC ، المملكة المتحدة).
Materials
| DNA name | Sequence |
| 37 G | 5′- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3′ |
| 37 T (2-Ap) | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
| 37 T | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
References
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. E. . Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).
- Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).
- Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).
- Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).
- Kunkel, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Erie, D. A. . DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).
- Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).
- Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochimie. 42 (25), 7682-7693 (2003).
- Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O’Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).
- Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochimie. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochimie. 37 (29), 10370-10380 (1998).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochimie. 43 (41), 13115-13128 (2004).
- Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).
- Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).
