Application des méthodes Kinetics stopped-flow pour étudier le mécanisme d'action d'une protéine réparation de l'ADN
Summary
MSH2-MSH6 est chargé d'initier la réparation des erreurs de réplication de l'ADN. Nous présentons ici une approche transitoire vers la compréhension de la cinétique comment cette protéine essentielle fonctionne. Le rapport illustre stopped-flow expériences pour mesurer la liaison à l'ADN et de la cinétique couplé ATPase sous-jacente MSH2-MSH6 mécanisme d'action en réparation de l'ADN.
Abstract
Transient analyse cinétique est indispensable pour comprendre le fonctionnement des macromolécules biologiques, car cette approche donne des informations mécanistiques et notamment les concentrations site actif et les constantes de vitesse intrinsèques qui régissent la fonction macromoléculaires. Dans le cas des enzymes, par exemple, des mesures transitoires Etat ou de pré-stable identifier et de caractériser les épreuves individuelles de la voie de réaction, alors que les mesures que l'état d'équilibre rendement global d'efficacité catalytique et la spécificité. Les épreuves individuelles telles que les protéines-protéines ou interactions protéine-ligand et de limitation de vitesse des changements de conformation se produisent souvent dans les délais milliseconde, et peuvent être mesurés directement par stopped-flow et aux produits chimiques étancher les méthodes d'écoulement. Etant donné un signal optique comme la fluorescence, stopped-flow est un outil puissant et accessible pour les progrès de la réaction de surveillance de liaison du substrat à la sortie du produit et de 1,2 roulement catalytique.
Nous rapportons ici l'application de stopped-flow cinétiques de sonder le mécanisme d'action de MSH2-MSH6, une protéine ADN eucaryote réparation qui reconnaît paires de bases inadéquations et d'insertion / délétion boucles dans l'ADN et de réparation des mésappariements signaux (ROR) 3-5. Ce faisant, MSH2-MSH6 augmente la précision de la réplication de l'ADN par trois ordres de grandeur (fréquence d'erreur diminue à partir de ~ 10 -6 à 10 -9 bases), et contribue ainsi à préserver l'intégrité du génome. Sans surprise, défectueux humaine MSH2-MSH6 fonction est associée à un cancer du côlon héréditaire sans polypose et d'autres cancers sporadiques 6-8. Afin de comprendre le mécanisme d'action de cette protéine ADN métaboliques critique, nous étudierons la dynamique de MSH2-MSH6 interaction avec l'ADN ne correspondent pas ainsi que l'activité ATPase qui alimente ses actions dans le ROR. Liaison à l'ADN est mesurée par le mélange rapide MSH2-MSH6 avec l'ADN contenant un 2-aminopurine (2-Ap) fluorophore à côté d'un G: T mismatch et le suivi de l'augmentation résultante de la 2-aminopurine de fluorescence en temps réel. L'ADN de dissociation est mesurée par le mélange de pré-formé MSH2-MSH6 G: T (2-Ap) complexes décalage avec l'ADN piège sans étiquette et la diminution de surveillance de la fluorescence au cours du temps 9. Pré-constante cinétique de l'ATPase État sont mesurés par le changement de fluorescence de 7-diéthylamino-3-((((2-maléimidyle) éthyl) amino) carbonyl) coumarine) protéine marquée Phosphate Binding (MDCC-PBP) sur le phosphate de liaison ( Pi) publié par MSH2-MSH6 suivantes hydrolyse de l'ATP 9,10.
Les données révèlent contraignantes rapide de MSH2-MSH6 à un G: Incompatibilité T et formation d'une longue durée de vie MSH2-MSH6 G: T complexes, ce qui entraîne à son tour dans la suppression de l'hydrolyse de l'ATP et la stabilisation de la protéine sous une forme liée à l'ATP . La cinétique de la réaction de fournir un soutien clair à l'hypothèse que l'ATP lié MSH2-MSH6 signaux réparation de l'ADN sur la liaison d'une paire de base ne correspondent pas à la double hélice.
F. Noah Biro et Jie Zhai contribué à ce document également.
Protocol
Discussion
L'exemple d'une protéine de liaison à l'ADN non-concordance décrit ici illustre la puissance et l'utilité des méthodes cinétiques transitoires pour étudier les mécanismes de molécules biologiques. Stopped-flow des mesures sur l'échelle de temps le chiffre d'affaires unique prévu preuves sans équivoque pour la liaison rapide et spécifique de MSH2-MSH6 protéine à une paire de base dépareillés et formation d'un complexe de longue durée protéine X de l'ADN dans la réaction…
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une bourse de carrière NSF (MMH), un Barry M. Goldwater bourse (FNB) et une bourse de recherche de premier cycle ASBMB (MDC). Le clone d'une sur-expression de PBP a été aimablement fourni par le Dr Martin Webb (MRC, Royaume-Uni).
Materials
| DNA name | Sequence |
| 37 G | 5′- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3′ |
| 37 T (2-Ap) | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
| 37 T | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
References
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. E. . Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).
- Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).
- Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).
- Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).
- Kunkel, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Erie, D. A. . DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).
- Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).
- Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochimie. 42 (25), 7682-7693 (2003).
- Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O’Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).
- Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochimie. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochimie. 37 (29), 10370-10380 (1998).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochimie. 43 (41), 13115-13128 (2004).
- Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).
- Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).
