Applicazione di metodi Stopped-flow Cinetica per Indagare sulla Meccanismo d'azione di una proteina di riparazione del DNA
Summary
MSH2-MSH6 è responsabile per l'avvio di riparazione di errori di replicazione del DNA. Qui vi presentiamo un approccio transitorio cinetica verso la comprensione di come lavora questa proteina critica. Il rapporto illustra stopped-flow esperimenti per misurare il legame del DNA accoppiati e cinetica ATPasi sottostante MSH2-MSH6 meccanismo d'azione nella riparazione del DNA.
Abstract
Transitori analisi cinetica è indispensabile per comprendere il funzionamento delle macromolecole biologiche, dal momento che questo approccio produce informazioni meccanicistico, inclusa la concentrazione sito attivo e costanti di velocità intrinseche che regolano la funzione macromolecolari. In caso di enzimi, per esempio, le misurazioni stato transitorio o pre-steady identificare e caratterizzare gli eventi individuali nel percorso di reazione, mentre le misurazioni stato stazionario solo resa complessiva efficienza catalitica e specificità. Singoli eventi, come proteina-proteina o proteina-ligando interazioni e rate-limiting cambiamenti conformazionali spesso si verificano in tempi millisecondo, e può essere misurato direttamente per stopped-flow e chimico-tempra metodi di flusso. Dato un segnale ottico come fluorescenza, stopped-flow è uno strumento potente ed accessibile per il progresso reazione monitoraggio da substrato vincolante al rilascio del prodotto e fatturato 1,2 catalitica.
Qui riportiamo applicazione di stopped-flow cinetica per sondare il meccanismo d'azione di MSH2-MSH6, una proteina eucariotica riparazione del DNA che riconosce base-pair mismatch e inserzione / delezione loop nel DNA e mancata corrispondenza dei segnali di riparazione (MMR) 3-5. In tal modo, MSH2-MSH6 aumenta l'accuratezza della replicazione del DNA da tre ordini di grandezza (frequenza di errore si riduce da ~ 10 -6 a 10 -9 basi), e quindi aiuta a preservare l'integrità genomica. Non sorprende, difettosi umano MSH2-MSH6 funzione è ereditario non associato a poliposi-cancro del colon e altri tumori sporadici 6-8. Al fine di comprendere il meccanismo d'azione di questa proteina fondamentale del metabolismo del DNA, stiamo sondando le dinamiche di MSH2-MSH6 interazione con il DNA non corrispondenti così come l'attività ATPasi che alimenta le sue azioni in MMR. Legame del DNA viene misurata mediante una rapida miscelazione MSH2-MSH6 con il DNA che contiene un 2-aminopurine (2-Ap) fluoroforo adiacente ad un G: T mancata corrispondenza e di monitoraggio il conseguente aumento della 2-aminopurine fluorescenza in tempo reale. DNA dissociazione si misura con la miscelazione pre-formate MSH2-MSH6 G: T (2-Ap) complesso di mancata corrispondenza con il DNA trappola senza etichetta e la diminuzione di monitoraggio della fluorescenza nel tempo 9. Pre-costante cinetica ATPasi statali sono misurati con la variazione di fluorescenza del 7-dietilammino-3-((((2-maleimidyl) etil) ammino) carbonile) cumarina)-etichettati fosfato Binding Protein (MDCC-PBP) su fosfato di legame ( Pi) pubblicato da MSH2-MSH6 seguenti idrolisi dell'ATP 9,10.
I dati rivelano vincolante rapida MSH2-MSH6 ad un G: mancata corrispondenza T e la formazione di una lunga durata MSH2-MSH6 G: T complesso, che a sua volta provoca la soppressione di idrolisi dell'ATP e la stabilizzazione della proteina in un ATP form associato . La cinetica di reazione di fornire un chiaro sostegno per l'ipotesi che l'ATP-bound-MSH2 MSH6 segnali di riparazione del DNA su una coppia di legame non corrispondenti base nella doppia elica.
F. Noè Biro e Jie Zhai contribuito a questo documento allo stesso modo.
Protocol
Discussion
L'esempio di una proteina di legame al DNA mancata corrispondenza qui descritto illustra la potenza e l'utilità di transitori metodi cinetici per lo studio dei meccanismi di molecole biologiche. Stopped-flow misura sulla scala singolo momento fatturato fornito prove inequivocabili per il legame rapido e specifico di proteine MSH2-MSH6 ad una coppia di basi non corrispondenti e la formazione di una lunga durata complesso proteina X del DNA nella reazione 9. Inoltre, stopped-flow (e dissetare-flo…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un premio CARRIERA NSF (MMH), una borsa di studio Barry M. Goldwater (FNB) e un premio ASBMB Undergraduate Research (CWD). Il clone di sovra-espressione di PBP è stato gentilmente fornito dal Dr. Martin Webb (MRC, UK).
Materials
| DNA name | Sequence |
| 37 G | 5′- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3′ |
| 37 T (2-Ap) | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
| 37 T | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
References
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. E. . Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).
- Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).
- Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).
- Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).
- Kunkel, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Erie, D. A. . DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).
- Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).
- Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochimie. 42 (25), 7682-7693 (2003).
- Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O’Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).
- Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochimie. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochimie. 37 (29), 10370-10380 (1998).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochimie. 43 (41), 13115-13128 (2004).
- Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).
- Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).
