Aplicação de Métodos Stopped fluxo de Cinética para investigar o mecanismo de ação de uma proteína de reparo do DNA
Summary
MSH2-MSH6 é responsável por iniciar reparação de erros de replicação de DNA. Aqui nós apresentamos uma abordagem cinética transitória para a compreensão crítica como esta proteína funciona. O relatório ilustra stopped-flow experimentos para medir a ligação DNA acopladas e cinética ATPase subjacente MSH2-MSH6 mecanismo de ação no reparo do DNA.
Abstract
Análise cinética transitória é indispensável para a compreensão do funcionamento de macromoléculas biológicas, uma vez que esta abordagem produz informações mecanicista incluindo concentrações sítio ativo e constantes de velocidade intrínseca que governam a função de macromoléculas. Em caso de enzimas, por exemplo, medições estado transiente ou pré-estável identificar e caracterizar os eventos individuais no caminho da reação, enquanto que as medições estado estacionário só o rendimento global de eficiência catalítica e especificidade. Eventos individuais, como a proteína-proteína ou proteína-ligante interações e limitação de taxa de mudanças conformacionais ocorrem frequentemente na escala de tempo de milissegundos, e pode ser medido diretamente pelo stopped-flow e químico-quench métodos de fluxo. Dado um sinal óptico, tais como fluorescência, stopped-flow serve como uma ferramenta poderosa e acessível para monitorar o progresso reação de substrato de ligação para lançamento do produto e volume de negócios 1,2 catalítico.
Aqui, relatamos a aplicação de stopped-flow cinética para investigar o mecanismo de ação de MSH2-MSH6, uma proteína de reparo do DNA eucariótico que reconhece pares de bases das disparidades e de inserção / deleção no DNA loops e reparar os sinais de incompatibilidade (MMR) 3-5. Ao fazer isso, MSH2-MSH6 aumenta a precisão da replicação do DNA por três ordens de magnitude (freqüência de erro diminui de ~ 10 -6 a 10 -9 bases), e assim ajuda a preservar a integridade genômica. Não surpreendentemente, com defeito função MSH2-MSH6 humano é associado com câncer de cólon hereditário não-polipose e outros cânceres esporádicos 6-8. A fim de compreender o mecanismo de ação dessa proteína metabólica crítica DNA, estamos investigando a dinâmica de MSH2-MSH6 interação com DNA incompatíveis, bem como a atividade de ATPase que alimenta suas ações no MMR. DNA de ligação é medida pela rápida mistura MSH2-MSH6 com DNA contendo a 2 aminopurina-(2-Ap) adjacente a um fluoróforo G: T incompatibilidade e acompanhamento do aumento resultante em 2 aminopurina-fluorescência em tempo real. DNA dissociação é medido através da mistura pré-formada MSH2-MSH6 G: T (2-Ap) complexo incompatibilidade com o DNA armadilha sem rótulo e diminuir monitoramento de fluorescência ao longo do tempo 9. Pré-ATPase constante cinética de estado são medidos pela mudança de fluorescência de 7-dietilamino-3-((((2-maleimidyl) etil) amino) carbonil) cumarina) marcado Protein Fosfato Binding (MDCC-PBP) em fosfato de ligação ( Pi) liberado pela MSH2-MSH6 seguintes ATP hidrólise 9,10.
Os dados revelam ligação rápida de MSH2-MSH6 para um G: Incompatibilidade de T e formação de uma vida longa MSH2-MSH6 G: T complexo, que resulta na supressão da ATP hidrólise e estabilização da proteína em um formulário de ATP-bound . A cinética da reação assegurar um apoio claro para a hipótese de que o ATP-bound MSH2-MSH6 sinais de reparo de DNA em ligação de um par de bases desiguais em dupla hélice.
F. Noah Biro e Jie Zhai contribuíram para este trabalho de forma igual.
Protocol
Discussion
O exemplo de uma proteína de ligação incompatibilidade DNA aqui descrita ilustra o poder e utilidade dos métodos transientes cinética para estudar os mecanismos de moléculas biológicas. Stopped-flow medições na escala de volume de negócios único momento, desde evidência inequívoca para a ligação rápida e específica de MSH2-MSH6 proteína para um par de bases incompatíveis e formação de uma vida longa complexo DNA-proteína X na reação 9. Além disso, parou de fluxo (e saciar-flow) análi…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma concessão de CARREIRA NSF (MMH), um Barry M. Goldwater bolsa (FNB) e um Prêmio de Pesquisa ASBMB Graduação (CWD). O clone de sobre-expressão do PBP foi gentilmente cedido pelo Dr. Martin Webb (MRC, UK).
Materials
| DNA name | Sequence |
| 37 G | 5′- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3′ |
| 37 T (2-Ap) | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
| 37 T | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
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