SiRNA अभिकर्मक के बाद समय चूक सूत्रीविभाजन की इमेजिंग

Summary

यहाँ हम छवि के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन और mitotic समय रहते siRNA अभिकर्मक के बाद स्तनधारी टिशू कल्चर कोशिकाओं के यों.

Abstract

सेलुलर संगठन और गुणसूत्र गतिशीलता है कि पिंजरे का बँटवारा दौरान होने में परिवर्तन कसकर जीनोमिक और सेलुलर सामग्री की सटीक इनहेरीटेंस सुनिश्चित करने के लिए समन्वय कर रहे हैं. समसूत्री विभाजन की पहचान की घटनाओं, जैसे गुणसूत्र आंदोलन एक व्यक्ति सेल विशिष्ट GFP टैग प्रोटीन व्यक्त स्तनधारी सेल लाइनों के समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के आधार पर आसानी से लगाया जा सकता है है. आरएनएआई आधारित रिक्तीकरण के साथ संयोजन में, इस पिंजरे का बँटवारा जहां दोष होते हैं, के बाद एक विशेष प्रोटीन का स्तर कम किया गया है (ओं) की अवस्था pinpointing के लिए एक शक्तिशाली तरीका हो सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम समसूत्री विभाजन के समय पर एक संभावित mitotic नियामक प्रोटीन घट के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक बुनियादी तरीका मौजूद है. कक्ष siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं, ऊष्मायन चरण शीर्ष चैम्बर में रखा, और एक स्वचालित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग imaged. हम वर्णन कैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए समय चूक प्रयोग, छवि दृश्यों की प्रक्रिया करने के लिए या तो अभी भी छवि montages या फिल्में बनाने के लिए सेट है, और कैसे और यों mitotic एक सेल लाइन का उपयोग कर व्यक्त चरणों के समय विश्लेषण mCherry – टैग histone H2B. अंत में, हम एक समय चूक प्रयोग की डिजाइनिंग के लिए महत्वपूर्ण विचार पर चर्चा की. इस रणनीति के अन्य तरीकों के लिए पूरक है और 1 के लाभ प्रदान करता है) कैनेटीक्स में परिवर्तन है कि जब सेल चक्र का उपयोग कर दवा उपचार सिंक्रनाइज़ करने के लिए आवश्यकता के बिना जनसंख्या और पिंजरे का बँटवारा के दो विश्लेषण) के रूप में कोशिकाओं को देख नहीं देखा जा सकता है संवेदनशीलता. ऐसे इमेजिंग प्रयोगों से दृश्य जानकारी न केवल समसूत्री विभाजन के उप – चरणों का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है, लेकिन यह भी अप्रत्याशित अंतर्दृष्टि है कि FACS द्वारा कोशिका चक्र विश्लेषण से स्पष्ट नहीं किया जाएगा प्रदान कर सकते हैं.

Protocol

siRNA अभिकर्मक और सेल तैयारी 4 अच्छी तरह LabTek द्वितीय संभाग coverglass fibronectin (10μg/mL) के प्रत्येक अच्छी तरह से है कि इस्तेमाल किया जा जाएगा 0.5ml जोड़कर तैयार करें. कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए सेते हैं. SiRNA / Lipofectamine RNAiMAX परिसरों (Invitrogen) के निर्माता के निर्देशों के अनुसार रिवर्स अभिकर्मक के लिए तैयार करें. चैम्बर प्रति 24 अच्छी तरह से एक डिश (100μL कुल) का इस्तेमाल किया जा अच्छी तरह से एक के लिए सिफारिश की मात्रा का प्रयोग करें. एक अनुरूप / siRNA अभिकर्मक के लिए उत्पाद प्रोटोकॉल प्रतिस्थापित किया जा सकता है. संभाग coverglass के कुओं से fibronectin निकालें. हर अच्छी तरह से है कि इस्तेमाल किया जाएगा siRNA / Lipofectamine RNAiMAX परिसरों के 100μL जोड़ें. +२०,००० विभाज्य histone H2B mCherry व्यक्त अच्छी तरह से अभिकर्मक मिश्रण युक्त प्रति कोशिकाओं (500μL में). कोशिकाओं ~ 24 घंटे के लिए नियमित रूप से सेल संस्कृति माध्यम के 1ml के साथ अभिकर्मक मिश्रण की जगह पहले सेते दें. छवि के अधिग्रहण से पहले सेते एक अतिरिक्त 24 घंटे कोशिकाओं (48 घंटे बाद अभिकर्मक). माइक्रोस्कोप सेटअप और छवि अधिग्रहण छवि अधिग्रहण सेटअप करने के लिए तीन मुख्य भागों हैं: 1) एक सेल इनक्यूबेटर कि खुर्दबीन मंच पर फिट बैठता है और 37 के एक निरंतर आर्द्र वातावरण रखता डिग्री सेल्सियस, और 5% सीओ 2, 2) एक स्वचालित मंच के साथ एक औंधा सुसज्जित खुर्दबीन, स्वचालित बंद प्रतिदीप्ति और brightfield, और स्वचालित फिल्टर पहियों, और 3) एक सॉफ्टवेयर पैकेज है कि एकीकृत नियंत्रण और मंच, बंद, और फिल्टर पहियों. हमारे इमेजिंग सेटअप में, हम OKO लैब से अनुकूलित सेल इनक्यूबेटर कि LabTek द्वितीय संभाग coverglass के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है का उपयोग करें. मंच, बंद, और फिल्टर पहियों Metamorph सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं सुझाव: OKO मंच शीर्ष इनक्यूबेटर प्रणाली लैब अलग थाली, पकवान, या coverslip आकार की एक किस्म के लिए एडाप्टर शामिल है. स्थिति पूर्व गर्म और equilibrated इनक्यूबेटर के ढक्कन खोलने adapter में संभाग coverglass रखने, और क्ले मॉडलिंग के साथ जगह में पकड़े LabTek द्वितीय इनक्यूबेटर में संभाग coverglass. संभाग coverglass पर कवर छोड़ो इतना है कि सेल संस्कृति के माध्यम से बाहर नहीं सूख जाएगा. ढक्कन बंद करें और खुर्दबीन मंच पर पूरे इनक्यूबेटर स्थिति सुनिश्चित करना है कि इनक्यूबेटर दृढ़ता जगह में आयोजित किया जाता है. Metamorph का प्रयोग, सॉफ्टवेयर के मेनू पट्टी में "Apps के / बहुआयामी अधिग्रहण" का चयन करके अपने प्रयोग सेट. यह एक विंडो जिसमें आप timelapse की आवृत्ति लंबाई का चयन कर सकते हैं लाना होगा, प्रत्येक रंग के लिए जोखिम समय (यदि एकाधिक सेटिंग कर), संख्या और मंच पदों के स्थान, और z-वर्गों की संख्या (अगर वांछित). का चयन करें जहाँ डेटा फ़ाइलों को बचाने के लिए सुझाव: यदि Metamorph की तुलना में अन्य सॉफ्टवेयर का उपयोग, कार्य थोड़ा अलग हो सकता है, लेकिन हो सकता है समग्र अवधारणा ही है. Micromanager, एक खुला स्रोत अधिग्रहण ImageJ आधारित सॉफ्टवेयर है कि सबसे हार्डवेयर setups के साथ संगत है, एक बेहतरीन विकल्प है . इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, हम दो तरंगदैर्य (brightfield और mCherry) 15 चरण सुझाव पदों पर 8 घंटे के लिए हर 15 मिनट पर छवियों को प्राप्त होगा: यदि बेहतर समय संकल्प वांछित है, तो आप अधिग्रहण के बीच समय अंतराल कम कर सकते हैं, लेकिन कम मंच पदों, प्रयोग किया जा सकता है और इस प्रकार कम mitotic कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए उपलब्ध हो जाएगा. यह महत्वपूर्ण है जब समय अंतराल खाते में फिल्टर करने के लिए फ़िल्टर सेट के बीच स्विच करने के लिए पहिया के लिए आवश्यक समय लेने के लिए विचार. पहले brightfield रोशनी का उपयोग कोशिकाओं के एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करके प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए इष्टतम समय जोखिम का निर्धारण करते हैं. सॉफ्टवेयर में, autofocus समारोह brightfield (यह प्रत्येक अधिग्रहण से पहले प्रत्येक चरण की स्थिति पर सॉफ्टवेयर autofocus करने की अनुमति देगा) सुझाव चैनल के लिए ही समायोजित: हम एक 40x सूखी उद्देश्य चरण विपरीत का उपयोग करने के लिए तेल के लिए आवश्यकता के बिना उत्कृष्ट संकल्प दे . अन्य उद्देश्यों वांछित ऑप्टिकल संकल्प पर निर्भर करता है इस्तेमाल किया जा सकता है. MCherry तरंग दैर्ध्य के लिए स्विच और एक छवि का उपयोग कर एक 50 मिसे जोखिम तस्वीर. एक अच्छी छवि को देख करने के लिए आवश्यक न्यूनतम करने के लिए जोखिम समय समायोजित करें. यह प्रकाश निरंतर सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के जोखिम की राशि की सीमा आवश्यक है. एक सामान्य नियम के रूप में, यह सबसे अच्छा के बजाय रोशनी ताकत को बढ़ाने के द्वारा एक तटस्थ घनत्व फिल्टर (उत्तेजना प्रकाश प्रवाह कम) और एक लंबी कैमरा जोखिम समय का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. किसी भी अतिरिक्त तरंगदैर्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ सुझाव: अपने प्रयोग के लिए एक भी जोखिम में लंबी अवधि के सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए, आप अस्थायी रूप से timepoint रिक्ति समायोजन करके वांछित timelapse पर छवियों की कुल संख्या एक सेल जीवित रह सकते हैं पूर्वावलोकन कर सकते हैं मिनट से सेकंड के लिए (यानी, 10 मिनट 10 सेकंड हो जाता है). यदि आपकी कोशिकाओं 1-200 (जोखिम या जीवित रहते हैंउपयुक्त संख्या), तो अपने जोखिम ठीक है. यदि नहीं, तो अपनी उत्तेजना प्रकाश, जोखिम समय, या छवियों की कुल संख्या को कम करने के लिए अपना पूरा प्रयोग अनुकरण. अगले चयन करें, और मंच पदों की एक उचित संख्या के निशान इतना है कि आप सेल की आबादी का पर्याप्त नमूने प्राप्त कर सकते हैं. रिकॉर्ड Metamorph पदों और प्रत्येक अधिग्रहण के लिए वहाँ से वापस आ जाएगी सुझाव: मैं आम तौर पर पदों में जो कक्षों की छवि के लिए बहुत कुछ कर रहे हैं मिल करने की कोशिश, लेकिन इतने नहीं कि वे बहुत घने हैं. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए पर्याप्त पदों का चयन करें ताकि आप समसूत्री विभाजन के माध्यम से प्रगति कक्षों की एक बड़ी संख्या में देख के एक अच्छा मौका होगा . सभी timelapse, तरंगदैर्ध्य जोखिम समय, मंच और स्थिति की जानकारी के बाद दर्ज किया गया है, तो स्क्रीन पर "पूर्वावलोकन" बटन निर्धारित करने के लिए यदि सॉफ्टवेयर उपकरण को नियंत्रित है उचित चयन करें. एक बार जब आप संतुष्ट हैं, अधिग्रहण शुरू करने के लिए स्क्रीन पर बटन "मोल" का चयन करें. तो वापस बैठते हैं और कंप्यूटर और के लिए काम करना खुर्दबीन की अनुमति सुझाव: अधिग्रहण के कम से कम एक पूरा दौर के माध्यम से स्वचालन निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करना है कि सब कुछ ठीक से काम कर रहा है. इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण अधिग्रहण के बाद समाप्त हो गया है, अगले कदम के लिए एक फार्म है कि संभालना आसान है में छवि डेटा अंतरण है. इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, मैं पहली बार प्रदर्शित होगा, कैसे Metamorph का उपयोग फिल्मों उत्पन्न करने के लिए तो कैसे ImageJ प्रोग्राम का उपयोग कर छवि montages उत्पन्न करने के लिए. किसी भी प्रारूप मात्रा का ठहराव के प्रयोजनों के लिए उपयोगी हो जाएगा. पहले कदम के लिए डेटा की समीक्षा है. ऐसा करने के लिए, मेनू पट्टी में "/ Apps समीक्षा बहुआयामी डेटा" का चयन करें. आपकी फ़ाइलों के स्थान का चयन करें, तो चुनें "देखें". यह आप प्रत्येक चरण की स्थिति से छवियों के ढेर की समीक्षा के लिए व्यक्तिगत रूप में की अनुमति देगा. वांछित चरण स्थिति का चयन करें, फिर "छवियाँ लोड". आप करने के लिए फ्रेम दर फ्रेम डेटा के माध्यम से अग्रिम सक्षम हो जाएगा. जो कोशिकाओं में समसूत्री विभाजन (के रूप में दोनों के डीएनए और सेलुलर आकारिकी द्वारा निर्धारित) के माध्यम से जाना उन मंच पदों के लिए, आप फिल्मों और montages Metamorph का उपयोग कर, या ImageJ (एनआईएच के माध्यम से मुफ्त के लिए उपलब्ध) जैसे अन्य कार्यक्रमों के साथ कर सकते हैं. Metamorph में एक फिल्म बनाने के लिए, "प्रक्रिया / फिल्म सहेजें" का चयन करें मेनू पट्टी में. आप जो उपयोग करने के लिए फ्रेम, गति, और फिल्म के फ़ाइल प्रकार का चयन करने के लिए में सक्षम हो जाएगा. फिर "सहेजें मूवी" का चयन करें. एक संग्रथित बनाने के लिए, मैं एक STK फ़ाइल के रूप में छवि ढेर बचाने के लिए, जो ImageJ जैसे अन्य कार्यक्रमों में इस्तेमाल किया जा सकता है. ImageJ में फ़ाइल खोलें और अग्रिम फ्रेम जब तक आप एक समसूत्री विभाजन के माध्यम से जा रहा सेल पाते. फसल सेल के आसपास के क्षेत्र और "छवि / डुप्लिकेट" चुनें संकेत: सभी फ्रेम डुप्लिकेट करने के लिए सुनिश्चित करें. एक संग्रथित बनाने के लिए, "छवि / ढेर / असेंबल करें" का चयन करें मेनू पट्टी में. यहाँ आप फ्रेम जो आप शामिल करने, असेंबल के आकार और आकृति करना चाहते निर्दिष्ट करें, और कर सकते हैं कि क्या आप फ्रेम के बीच सीमाओं चाहते हैं. इन का चयन करें और हिट "ठीक है". सुझाव एक tif फ़ाइल के रूप में असेंबल सहेजें और या तो ImageJ या Adobe Photoshop में किसी भी आगे की प्रक्रिया करते हैं. 16 – बिट 8 बिट प्रारूप Metamorph द्वारा आसान छवि प्रसंस्करण के लिए इस्तेमाल किया प्रारूप से असेंबल फाइलें बदलें. पिंजरे का बँटवारा के विभिन्न चरणों में समय की गणना निर्धारित करते हैं, टी = 0 (डीएनए संक्षेपण या सेल गोलाई का पहला संकेत), तख्ते की संख्या गिनती जब तक गुणसूत्रों (prophase / prometaphase में समय) भूमध्य रेखा, तख्ते पर गठबंधन कर रहे हैं जब तक गुणसूत्रों अलग शुरू (मेटाफ़ेज़ समय में), और फ्रेम जब तक कोशिकाओं समतल करने के लिए शुरू (anaphase / / telophase cytokinesis). प्रत्येक mitotic चरण में गणना समय प्रत्येक फ्रेम के बीच समय अंतराल पर निर्भर करता है. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1 में एक ठेठ नियंत्रण siRNA अभिकर्मक HeLa सेल histone H2B – mCherry व्यक्त लाइन का उपयोग करके प्रयोग से परिणाम दिखाता है . का यह तरीका प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया गया है mitotic समय यों, देर से एक पिंजरे का बँटवारा के समय में एक nucleoporin Nup153 लिए अप्रत्याशित भूमिका का खुलासा. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.

Discussion

इमेजिंग और फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रौद्योगिकी में हाल के अग्रिमों के साथ, जी इमेजिंग सेलुलर ^{विश्लेषण} 2 के एक नियमित पहलू बन गया है . GFP की एक किस्म (और अन्य रंग वेरिएंट ³⁾ टैग प्रोटीन व्यापक रूप से उपलब्ध है या अपेक्षाकृत आसान करने के लिए निर्माण कर रहे हैं और डीएनए गुणसूत्र ^/ 4 ^{गतिशीलता, 5, centrosome} 6 दोहराव, cyclin बी गतिशीलता सहित कोशिका विभाजन पहचान का एक संख्या ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ^7, परमाणु लिफाफा टूटने और reassembly ^{8, 9,} mitotic धुरा ¹⁰ गठन, और ¹¹ cytokinesis के विभिन्न चरणों. टैग की गईं प्रोटीन अकेले या संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है जब फ्लोरोसेंट टैग के स्पेक्ट्रा / उत्तेजना उत्सर्जन संगत कर रहे हैं, अनुमति विशिष्ट घटनाओं के बीच समन्वय मूल्यांकन किया. यदि अधिक से अधिक स्थानिक और / या अस्थायी संकल्प है / वांछित हैं, confocal माइक्रोस्कोपी कि लेजर स्कैनिंग, कताई डिस्क, या प्रतिध्वनि स्कैनिंग इस्तेमाल किया जा सकता है, और बढ़ती संकल्प के साथ परिष्कृत माइक्रोस्कोपी विकल्पों की सूची बढ़ने के लिए जारी है. स्तनधारी कोशिकाओं में समसूत्री विभाजन की लाइव इमेजिंग भी उच्च throughput आरएनएआई और छोटे अणु स्क्रीन ^12-14 में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया गया है है. इस प्रकार, जबकि एक प्रारंभिक प्रयोगों इस तकनीक का उपयोग अपेक्षाकृत आसान हो सकता है है, इस रणनीति पर निर्माण के लिए संभावनाएं व्यापक हैं.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Lipofectamine RNAiMAX		Invitrogen	13778-075
Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well)		Thermo Scientific	12-565-337	Additional chamber sizes are available
Fibronectin		Sigma	F1141
Stage-top cell incubator		OKO Lab		Can use any appropriate chamber
Automated inverted fluorescence microscope		Olympus		Can use any appropriate microscope
Software package		Metamorph		Can use any appropriate software