स्तनधारी कक्ष में glycoproteins से पल्स पीछा एन जुड़े चीनी चेन का विश्लेषण
Summary
हम एन जुड़े glycans के स्तनधारी कोशिकाओं में अपने biosynthesis के बाद glycoproteins के प्रारंभिक जीवन के माध्यम से परिवर्तन के विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन. यह नाड़ी पीछा metabolically लेबल glycans, glycoproteins और HPLC द्वारा परीक्षा से enzymatic रिलीज के विश्लेषण के द्वारा हासिल की है.
Abstract
GLC की कुर्की<sub> 3</sub> मनुष्य<sub9></sub> GlcNAc<sub2></sub> ईआर में नवजात polypeptides oligosaccharide अग्रदूत स्रावी प्रोटीन के लिए एक आम संशोधन है. हालांकि इस संशोधन कई जैविक प्रक्रियाओं में फंसा था, अपने कार्य के अतिरिक्त पहलुओं, ग्लाइकोप्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण और अवैध व्यापार के लिए संकेतों के उत्पादन में अपनी भूमिका के हाल ही में सबूत के साथ उभर रहे हैं. इस प्रकार, एन जुड़े glycans और उनके प्रसंस्करण से संबंधित घटना अधिकता जांच की जा रही हैं. तरीके है कि हाल ही में प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए विकसित किया गया है बहुत ग्लाइकोप्रोटीन एन से जुड़े glycans के लक्षण वर्णन में सुधार हुआ है. फिर भी, वे चीनी श्रृंखला शामिल प्रसंस्करण की गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते. इस के लिए, लेबलिंग और नाड़ी पीछा विश्लेषण प्रोटोकॉल इस्तेमाल किया जाता है कि आम तौर पर जटिल हैं और बहुत कम पैदावार दे. हम यहाँ अलगाव और metabolically लेबल एन से जुड़े oligosaccharides के विश्लेषण के लिए एक सरल विधि का वर्णन. 2 [के साथ कोशिकाओं की लेबलिंग प्रोटोकॉल पर आधारित है -<sup> 3</sup> एच] mannose, denaturing और या तो ब्याज की एक विशेष रूप से immunoprecipitated प्रोटीन से या एंडो एच और एन glycosidase एफ के साथ अनुक्रमिक उपचार, आणविक निस्पंदन (Amicon) द्वारा पीछा द्वारा सामान्य ग्लाइकोप्रोटीन पूल से oligosaccharides के enzymatic रिलीज lysis. इस विधि में पृथक oligosaccharides HPLC विश्लेषण, जो monosaccharide उन्हें शामिल इकाइयों की संख्या के अनुसार विभिन्न glycan संरचनाओं के बीच भेदभाव की अनुमति देता है के लिए एक इनपुट के रूप में एक एकल monosaccharide के एक संकल्प के साथ सेवा. इस पद्धति का उपयोग करके हम सामान्य परिस्थितियों में नाड़ी – पीछा के बाद और एंटीबॉडी निषेध के तहत उच्च कुल सेल glycoproteins की mannose एन से जुड़े oligosaccharide प्रोफाइल का अध्ययन करने में सक्षम थे. इन प्रोफाइल एक immunoprecipitated गिरावट ईआर जुड़े सब्सट्रेट (ERAD) से प्राप्त उन लोगों के लिए तुलना में थे. हमारे परिणाम बताते हैं कि सबसे एनआईएच 3T3 सेलुलर glycoproteins अपेक्षाकृत स्थिर हैं और है कि उनके oligosaccharides के सबसे मनुष्य के लिए छंटनी कर रहे हैं<sub9-8></sub> GlcNAc<sub2></sub>. इसके विपरीत, अस्थिर ERAD substrates मैन छंटनी करने के लिए कर रहे हैं<sub6-5></sub> GlcNAc<sub2></sub> और इन प्रजातियों असर glycoproteins proteasomal गिरावट के निषेध पर जमा.
Protocol
Discussion
नाड़ी पीछा HPLC जुदाई के साथ जीवित कोशिकाओं में glycans का विश्लेषण एक glycoprotein के जीवन भर oligosaccharide संरचनात्मक परिवर्तन की गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक तरीका प्रदान करता है. वहाँ बढ़ती सबूत है कि इस तरह के परिवर्तन ई?…
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए Zehavit Frenkel और सैंड्रा Tolchinsky धन्यवाद. इस काम से संबंधित अनुसंधान के इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (1229-1207) और जर्मन इजरायल परियोजना सहयोग (डुबकी DFG) से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | ||
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck Bioscience | 1.0003 | ||
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | Millipore | UFC503024 or 4208 | ||
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | ||
| Dialyzed Foetal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco Invitrogen Cell Culture | 41965039 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | ||
| EDTA disodium salt (Titriplex Iii) | Merck | 1084180250 | ||
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | ||
| Foetal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | ||
| Frac-100 fraction collector | Amersham Biosciences | 18-1000-77 | ||
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter | 510720 | ||
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer Life Sciences | NET570A | ||
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | ||
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche | 11365177 | ||
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | ||
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1658 | ||
| Opti-Flour | PerkinElmer Life Sciences | 6013199 | ||
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | ||
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | ||
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | ||||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | ||
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-RAD | 161-0301 | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | ||
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | ||
| Triton X-100 | BDH | 306324N | ||
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | ||
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | ||||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | ||||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
