Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Zuckerketten von Glykoproteinen in Säugerzellen
Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zur Analyse der Veränderung der N-Glycane durch das frühe Leben von Glykoproteinen nach ihrer Biosynthese in Säugetierzellen. Dies wird durch Puls-Chase Analyse der metabolisch markierten Glykane, enzymatische Freisetzung von Glykoproteinen und Prüfung durch HPLC erreicht.
Abstract
Die Befestigung der Glc<sub> 3</sub> Man<sub> 9</sub> GlcNAc<sub> 2</sub> Vorläufer Oligosaccharid entstehenden Polypeptide in der Notaufnahme ist eine übliche Variante für sekretorische Proteine. Obwohl diese Änderung in mehrere biologische Prozesse verwickelt war, sind weitere Aspekte ihrer Funktion entstehenden, mit den letzten Beweis für seine Rolle in der Produktion von Signalen für Glykoprotein Qualitätskontrolle und-handel. So sind Phänomene im Zusammenhang mit N-Glycane und deren Verarbeitung intensiv untersucht. Methoden, die kürzlich für Proteomanalyse entwickelt haben stark die Charakterisierung von Glykoprotein N-Glycane verbessert. Dennoch liefern sie keine Einsicht in die Dynamik des Zuckers Kette der Verarbeitung beteiligt. Dafür sind die Kennzeichnung und Pulse-Chase Analyse-Protokolle verwendet, sind meist komplex und geben sehr geringen Ausbeuten. Wir beschreiben hier eine einfache Methode zur Isolierung und Analyse von metabolisch markierten N-gebundene Oligosaccharide. Das Protokoll ist für die Kennzeichnung von Zellen mit [2 basiert -<sup> 3</sup> H] Mannose, denaturierenden Lyse und enzymatische Freisetzung der Oligosaccharide entweder aus einem speziell immunpräzipitiert Protein von Interesse oder aus dem allgemeinen Glykoprotein-Pool durch sequentielle Behandlung mit Endo H und N-Glycosidase F, durch molekulare Filtration (Amicon) gefolgt. Bei dieser Methode der isolierten Oligosaccharide dienen als Input für die HPLC-Analyse, die eine Diskriminierung zwischen verschiedenen Glykanstrukturen ermöglicht je nach Anzahl der Monosaccharideinheiten aus ihnen, mit einer Auflösung von einem Monosaccharid. Mit dieser Methode konnten wir hohe Mannose N-linked Oligosaccharid Profile von insgesamt Zelle Glykoproteine nach Pulse-Chase in normalen Bedingungen und unter Proteasom-Hemmung. Diese Profile wurden mit denen aus einem immunpräzipitiert ER-assoziierte Degradation (ERAD) Substrat verglichen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die meisten NIH 3T3 Zellen Glykoproteine relativ stabil sind und dass die meisten ihrer Oligosaccharide sind auf den Menschen zugeschnitten<sub> 9-8</sub> GlcNAc<sub> 2</sub>. Im Gegensatz dazu sind instabil ERAD Substrate Man getrimmt<sub> 6-5</sub> GlcNAc<sub> 2</sub> Und Glykoproteine tragen diese Arten sammeln auf Hemmung der Proteasom abgebaut.
Protocol
Discussion
Die Pulse-Chase Analyse der Glykane in lebende Zellen mit HPLC-Trennung bietet eine Methode zur Untersuchung der Dynamik von Oligosaccharid bauliche Veränderungen während der gesamten Lebensdauer eines Glykoproteins. Es gibt zunehmend Beweise, dass solche Änderungen bei der Erzeugung der Signale für ER falten, Qualitätskontrolle und-handel Systemen 2-5 sind beteiligt. Die Methode kann nicht nur für einen bestimmten Glykoprotein von Interesse, sondern auch für die Analyse der Dynamik der Struktur der ge…
Acknowledgements
Wir danken Zehavit Frenkel und Sandra Tolchinsky für technische Unterstützung. Forschung im Zusammenhang mit dieser Arbeit wird durch Zuschüsse von der Israel Science Foundation (1229-1207) und Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP-DFG) unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | ||
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck Bioscience | 1.0003 | ||
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | Millipore | UFC503024 or 4208 | ||
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | ||
| Dialyzed Foetal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco Invitrogen Cell Culture | 41965039 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | ||
| EDTA disodium salt (Titriplex Iii) | Merck | 1084180250 | ||
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | ||
| Foetal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | ||
| Frac-100 fraction collector | Amersham Biosciences | 18-1000-77 | ||
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter | 510720 | ||
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer Life Sciences | NET570A | ||
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | ||
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche | 11365177 | ||
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | ||
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1658 | ||
| Opti-Flour | PerkinElmer Life Sciences | 6013199 | ||
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | ||
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | ||
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | ||||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | ||
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-RAD | 161-0301 | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | ||
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | ||
| Triton X-100 | BDH | 306324N | ||
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | ||
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | ||||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | ||||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
