स्वचालित और zebrafish रासायनिक स्क्रीन के लिए इमेजिंग विश्लेषण का विकास.

Summary

हम स्वचालित और multiwell प्लेटों में zebrafish ट्रांसजेनिक भ्रूण के इमेजिंग विश्लेषण के लिए एक प्रणाली के विकास रिपोर्ट. यह fibroblast वृद्धि कारक रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति पर एक छोटा सा अणु, बीसीआई, की खुराक पर निर्भर प्रभाव को मापने और उच्च throughput zebrafish रासायनिक स्क्रीन की स्थापना के लिए प्रौद्योगिकी प्रदान करने की क्षमता को दर्शाता है.

Abstract

हम छवि आधारित स्क्रीनिंग उच्च सामग्री (HCS) छोटे अणुओं है कि zebrafish भ्रूण में FGF / रास / MAPK मार्ग न्यूनाधिक कर सकते हैं की पहचान पद्धति के आवेदन प्रदर्शित करता है. zebrafish भ्रूण में vivo में उच्च सामग्री रासायनिक स्क्रीन के लिए एक आदर्श व्यवस्था है. 1 दिन पुराने भ्रूण लगभग 1mm व्यास में और आसानी से 96 अच्छी तरह प्लेटें, उच्च throughput प्रदर्शन के लिए एक मानक प्रारूप में arrayed कर सकते हैं. विकास के पहले दिन के दौरान, भ्रूण प्रमुख उपस्थित अंगों के अधिकांश के साथ पारदर्शी होते हैं, इस प्रकार embryogenesis दौरान ऊतक गठन के दृश्य को सक्षम. zebrafish रासायनिक स्क्रीन के पूरा स्वचालन अभी भी एक चुनौती है, लेकिन स्वचालित छवि के अधिग्रहण और विश्लेषण के विकास में विशेष रूप से,. हम पहले एक ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइन है कि FGF गतिविधि के नियंत्रण के अधीन हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त उत्पन्न और रासायनिक स्क्रीन में उनकी उपयोगिता का प्रदर्शन¹. उच्च throughput पूरे जीव स्क्रीन के लिए पद्धति स्थापित करने के लिए, हम 24-48 घंटे के पोस्ट निषेचन (HPF) में 96 अच्छी तरह प्लेटें में स्वचालित और zebrafish भ्रूण की इमेजिंग विश्लेषण के लिए एक प्रणाली विकसित<sup2></sup>. इस वीडियो में हम multiwell प्लेटों में 24hpf में ट्रांसजेनिक भ्रूण arraying के लिए प्रक्रियाओं पर प्रकाश डाला और एक छोटा सा अणु (बीसीआई) के अलावा है कि FGF संकेतन hyperactivates³. प्लेटों के 6 tricaine के अलावा आण्विक डिवाइसेज ImageXpress अल्ट्रा स्कैनिंग लेजर confocal HCS पाठक पर स्वचालित इमेजिंग के लिए पहले लार्वा anesthetize द्वारा पीछा घंटे के लिए incubated हैं. छवियाँ Definiens डेवलपर एक अनुभूति नेटवर्क प्रौद्योगिकी एल्गोरिथ्म है कि हम पता लगाने और ट्रांसजेनिक भ्रूण के सिर में GFP की अभिव्यक्ति यों विकसित का उपयोग सॉफ्टवेयर द्वारा संसाधित कर रहे हैं. इस उदाहरण में हम एल्गोरिथ्म इलाज भ्रूण में GFP रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति पर बीसीआई की खुराक पर निर्भर प्रभाव को मापने की क्षमता पर प्रकाश डाला.

Protocol

1) zebrafish matings और बीसीआई उपचार सेट. Pt6 zebrafish और जगह संभोग एक टैंक में व्यक्तिगत: दो दिन के इलाज के लिए पहले, homozygous पुरुष (d2eGFP dusp6) टीजी की पहचान. विभाजक जोड़ें और एक जंगली प्रकार अटल बिहारी * महिला मछली और संभोग पिंजरों में रात भर छोड़. अगली सुबह के विभाजक निकालने के लिए, और 1 घंटे के बाद भ्रूण को इकट्ठा. 100mm व्यंजन E3 (5 मिमी NaCl, .17 मिमी KCl, .33 मिमी CaCl2, 0.33 MgSO4 मिमी), और 6 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर समाधान सेते के साथ भ्रूण स्थानांतरण. मृत निकालें और भ्रूण unfertilized, ताजा E3 समाधान जोड़ने के लिए, और रातोंरात सेते हैं. इसी तरह (24hpf) मंच और वर्दी GFP अभिव्यक्ति के लिए ट्रांसजेनिक भ्रूण के आधार पर क्रमबद्ध. एक 96 – अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में ऐरे व्यक्तिगत भ्रूण. एक micropipette के साथ अतिरिक्त E3 समाधान निकालें. E3 के समाधान के 200μl प्रत्येक कुएं में एक मल्टी चैनल pipettor के साथ जोड़ें. निम्नलिखित के रूप में सूचीबद्ध यौगिकों जोड़ें: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 एक 2μl DMSO 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl DMSO बी 2μl DMSO 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl DMSO सी 2μl DMSO 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl DMSO डी 2μl DMSO 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl DMSO ई 2μl DMSO 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl DMSO एफ 2μl DMSO 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl DMSO जी 2μl DMSO 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mएम) 2μl DMSO एच 2μl DMSO 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl बीसीएल (0.1mm) 2μl बीसीएल (0.5mm) 2μl बीसीएल (1mm) 2μl बीसीएल (2mm) 2μl बीसीएल (2.5mm) 2μl DMSO अंतिम सांद्रता 1μM हैं, 5μM, 10μM, 20μM, 25μM बीसीआई में 1% DMSO. कवर एल्यूमीनियम पन्नी में थाली और 28 पर 6 घंटे के लिए सेते ° सी. 2) 96 अच्छी तरह प्लेटें और विश्लेषण स्वचालित इमेजिंग. एक अच्छी तरह से tricaine (0.61mM) के 10μl जोड़ें 30hpf भ्रूण anesthetize. आण्विक डिवाइसेज Imagexpress अल्ट्रा में थाली लोड. ओपन Metaxpress सॉफ्टवेयर. एक 4x उद्देश्य और अधिकतम pinhole व्यास के साथ एक विन्यास को चुनें, लेजर autofocus प्लेट नीचे का पता लगाने के लिए कॉन्फ़िगर करने के लिए, और इष्टतम Z विमान हित के क्षेत्रों का पता लगाने के लिए निर्धारित है. 488/525 एनएम (GFP) / उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्य पर छवियों का मोल. कोई binning साथ 2000×2000 पिक्सल (4 x 4 मिमी) की एक एक साइट के रूप में क्षेत्र स्कैन सेट. लेसर शक्ति कॉन्फ़िगर और सकारात्मक नियंत्रण छवियों में ऐसी है कि प्रतिभाशाली क्षेत्रों लाभ तर नहीं है. कई सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कुओं में उचित छवि अधिग्रहण की पुष्टि करें. प्लेट स्कैन शुरू करो. साधन स्वचालित रूप से सभी कुओं और उन्हें एक SQL सर्वर डेटाबेस में संग्रह से छवियों को प्राप्त होगा. Definiens डेवलपर का उपयोग Cellenger आवेदन मॉड्यूल और एक आयात फिल्टर है कि छवि प्रारूप और फ़ाइल संरचना आण्विक डिवाइसेज Imagexpress अल्ट्रा मंच द्वारा उत्पन्न पहचानता में छवियों को अपलोड करें. एक कस्टम डिजाइन अनुभूति नेटवर्क प्रौद्योगिकी एल्गोरिथ्म (यह भी कहा ruleset) के साथ प्रक्रिया छवियाँ. एल्गोरिथ्म, जो हम कस्टम एक हाल ही में प्रकाशित 2 ruleset के आधार पर विकसित करने के लिए स्वचालित रूप से भ्रूण, जर्दी, और सिर की पहचान है, और चमक और GFP-व्यक्त सिर संरचनाओं के क्षेत्र यों के लिए डिज़ाइन किया गया है. वेल्स जो में कोई भ्रूण का पता चला है या जहां सिर असंदिग्ध रूप से हो सकता है (उदाहरण के लिए, उच्च परिसर या ध्यान केंद्रित छवियों की विषाक्तता के साथ बाहर) असाइन नहीं कर सकते हैं विश्लेषण से बाहर रखा गया है. एल्गोरिथ्म का उपयोग कर कई नकारात्मक नियंत्रण (इलाज वाहन) छवियों और सकारात्मक नियंत्रण छवियों (बीसीआई इलाज) ऐसी है कि सिर और जर्दी को सही ढंग से दोनों में पहचान कर रहे हैं कॉन्फ़िगर. सेट एक "सिर संरचनाओं" मतलब जर्दी तीव्रता के गुणकों के रूप में पहचान दहलीज तक उज्ज्वल सिर संरचनाओं का पता लगाने के दृश्य प्रेक्षण से मेल खाता है. पैरामीटर को परिभाषित करने के लिए निर्यात. इस उदाहरण में, सबसे जानकारीपूर्ण पैरामीटर कुल एकीकृत चमक सिर के भीतर GFP सकारात्मक क्षेत्रों, इसके बाद "कुल सिर संरचनाओं चमक (चित्र 1) करार दिया था. चित्रा 1 ग्राफ़ ट्रांसजेनिक भ्रूण में GFP अभिव्यक्ति पर बीसीआई की खुराक निर्भर प्रभाव depicitng. सभी थाली एकीकृत नौकरी अनुसूचक का उपयोग कर छवियों पर एल्गोरिथ्म चलाएँ. Definiens सॉफ्टवेयर कई प्रोसेसर ("इंजन") पर वितरित अभिकलन का उपयोग करता है, एकाधिक छवियों के साथ – साथ विश्लेषण सक्षम करने से. एल्गोरिथ्म संख्यात्मक छवि विश्लेषण, विश्लेषण के साथ जो डेटाबेस में बच रहे हैं संसाधित छवि की एक प्रति के साथ एक साथ लागू से परिणामों पर आधारित उपायों की गणना करता है. प्रतिनिधि परिणाम: के बाद सभी छवियों का विश्लेषण कर रहे हैं, डेटा Cellenger के भीतर देखे जा या आगे के विश्लेषण और ग्राफिकल प्रतिनिधित्व के लिए तीसरे पक्ष के सॉफ़्टवेयर (एक्सेल, GraphPad चश्मे) को निर्यात कर सकते हैं. चित्रा 2 से पता चलता है एक इलाज वाहन से स्कैन छवियों को संग्रहीत और एक अच्छी तरह से और CNT विश्लेषण के बिना लागू, बीसीआई का इलाज. Pt6 भ्रूण: 1 दस्तावेजों टीजी में GFP रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति (d2EGFP dusp6) पर एक खुराक पर निर्भर बीसीआई के प्रभाव चित्रा. एक आधा अधिक से अधिक प्रतिक्रिया (EC50) को प्रकाश में लाना करने के लिए आवश्यक एकाग्रता लगभग 12 सुक्ष्ममापी था. चित्रा 2 स्वचालित छवि और ट्रांसजेनिक zebrafish भ्रूण के कब्जा विश्लेषण. 30hpf में pt6 भ्रूण: (ए) DMSO वाहन (d2eGFP dusp6) टीजी के इलाज . (बी) ट्रांसजेनिक 20μM बीसीआई शो के साथ इलाज किया भ्रूण GFP अभिव्यक्ति में बढ़ जाती है. भ्रूण की छवि (सी) से (ए) के सिर में GFP अभिव्यक्ति पा ruleset Definiens चलाने के बाद. ऑरेंज स्पॉट निरूपित जहां सॉफ्टवेयर GFP तीव्रता के उपाय. (डी) से भ्रूण की छवि (बी) के सिर में GFP अभिव्यक्ति पा ruleset Definiens चलने के बाद. ऑरेंज स्पॉट निरूपित जहां सॉफ्टवेयर GFP तीव्रता के उपाय. ध्यान दें कि ruleset इलाज भ्रूण में GFP अभिव्यक्ति की एक विस्तारित क्षेत्र को खोजने के लिए सक्षम था.

Discussion

एक प्रमुख zebrafish रासायनिक स्क्रीन के throughput सीमित कारक पद्धति की व्यवस्थित प्रक्रिया 96 अच्छी तरह इमेजिंग और विश्लेषण के लिए प्लेटों के लिए कमी है. क्योंकि multicellular जीवों की छवियों जटिल, कम विपरीत हैं, और प्रकृति में विषम, मौजूदा छवि विश्लेषण एल्गोरिदम का पता लगाने के लिए और जीव के भीतर विशिष्ट संरचनाओं यों असफल. हाल प्रकाशित zebrafish रासायनिक स्क्रीन इसलिए समर्पित कर्मियों द्वारा अलग – अलग कुओं के दृश्य प्रक्रिया के दौरान परीक्षा शामिल है. यह आमतौर पर संख्यात्मक readouts की पीढ़ी और स्क्रीन छवियों और डेटा के एक पूरा संग्रह रोकता है. इसके अलावा, पुस्तिका मूल्यांकन छवि – आधारित स्क्रीनिंग, अर्थात् करने के लिए स्क्रीन प्रदर्शन के पूर्वव्यापी विश्लेषण आचरण, प्ररूपी परिवर्तन है कि स्क्रीनिंग अभियान (जैसे, विषाक्तता, या विकास संबंधी दोषों) के प्राथमिक ध्यान केंद्रित नहीं थे की जांच करने के लिए और पार करने की क्षमता के कई महत्वपूर्ण लाभ समाप्त अतीत या भविष्य एक ही परिसर पुस्तकालय का उपयोग कर स्क्रीन के साथ संदर्भ स्क्रीनिंग डेटा.

इस रिपोर्ट में हम उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के बिना स्वचालित और multiwell प्लेटों में zebrafish भ्रूण के इमेजिंग और विश्लेषण के लिए पद्धति पर प्रकाश डाला. 96 अच्छी तरह प्लेटें में ^pt6 भ्रूण और एक छवि विश्लेषण 'Definiens अनुभूति नेटवर्क है कि मात्रा निर्धारित GFP प्रौद्योगिकी पर आधारित एल्गोरिथ्म विकसित: हम एक ImageXpress अल्ट्रा छवि (d2EGFP dusp6) टीजी स्कैनिंग लेजर confocal पाठक (आण्विक उपकरण, सनीवेल, सीए) पर स्वचालित छवि पर कब्जा ट्रांसजेनिक भ्रूण के सिर में अभिव्यक्ति. विधि वर्गीकृत प्रतिक्रियाओं दिया और एक छोटा सा अणु FGF संकेतन के उत्प्रेरक के vivo गतिविधि में मात्रा निर्धारित है. Epifluorescence आधारित ArrayScan द्वितीय (Cellomics इंक, पिट्सबर्ग PA) के साथ इसी तरह के परिणाम प्राप्त किया गया कि यह संभव है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लेट पाठकों की एक ^{किस्म} 2 पर zebrafish भ्रूण की स्वचालित छवि पर कब्जा को लागू करने का दस्तावेजीकरण. पद्धति के विकास के लिए स्वचालित रूप से बहुकोशिकीय जीव छवियों का विश्लेषण एक मानव पर्यवेक्षक द्वारा दृश्य स्कोरिंग के लिए की जरूरत का सफाया और पीढ़ी और पूर्वव्यापी विश्लेषण और भविष्य स्क्रीन के साथ तुलना के लिए संख्यात्मक डेटा और छवियों के संग्रह सक्षम होना चाहिए.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Tricaine (MS222)		Sigma	Cat.# A-5040