Denna metod användes i forskningen redovisas i Pomerantz och O'Donnell, 327 Vetenskap, 590-592 (2010) . 1. Montering av ett stoppades RNAP förlängning komplex utfördes enligt följande: 500 nm slutlig koncentration av E. coli RNAP σ 70 HE var blandad med 5 nM slutlig koncentration av ett biotinylerad 3,6 kb DNA-mall som innehåller T7A1 promotor i 100 l av buffert A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mm MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycerol) i 10 min vid 37 ° C. 100 mikroM av Apu och 40 mikroM var och en av GTP, ATP och CTP lades ytterligare 10 minuter vid 37 ° C. 2. Fixering av stoppades RNAP töjning komplex på streptavidin pärlor utfördes enligt följande: 200 ìl streptavidin magnetiska belagda kulor (Invitrogen) lades till reaktionen ovan för 10 min vid rumstemp. 3. Rening av stoppades immobiliserade RNAP töjning komplex utfördes enligt följande: Kulorna (från ovan) spolades 5 gånger med 0,9 ml av buffert A som innehåller 0,75 M NaCl, 200 mikrogram / ml heparin och 20 mikrogram / ml ssDNA (Supernatanten togs bort efter varje tvätt steg för magnetisk separering.) Nästa, den pärlor spolades 2 gånger med 0,9 ml buffert A. 4. Bildande av ett replikationsgaffeln nedströms i förhållande till huvud-på RNAP utfördes enligt följande: Kulorna (från ovan) var återsuspenderade i 100 l av New England Biolabs buffert 4 och 10 enheter av Sap I (New England Biolabs) lades i 10 min vid 37 ° C. Kulorna spolades 3 gånger med 0,9 ml av buffert A och sedan suspenderade i 50 ìl Quick T4 Ligation reaktion buffert (New England Biolabs). 2 ìl av Quick T4 ligas (New England Biolabs) inkom tillsammans med 6 nM slutlig koncentration av pre-glödgat kluven DNA (RP10, RP22, RP25) i 10 min vid rumstemp. Kulorna spolades 3 gånger med 0,9 ml buffert A. 5. Montering av replisome och initiering av ledande strand syntes på replikationsgaffeln utfördes enligt följande: 448 pmol av DnaB (som hexamer) var inkuberas med pärlor 150 l av buffert A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mm MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mm DTT, 10% glycerol) i 30 s vid 23 ° C. 4,9 pmol av Pol III * (Pol III HE minus β), 15 pmol av β, 2 mm ATP och 60 mikroM varje dGTP och dATP lades till en volym av 200 l och inkuberas ytterligare 5 minuter vid 37 ° C. Replikering inleddes efter att lägga till 10 mikrogram SSB och 24 mikroM varje dATP och dTTP tillsammans med [α-32 P] dTTP och [α-32 P] dCTP (specifik verksamhet, 3,000-5,000 CPM / pmol) till en slutlig volym på 250 mikroliter. Reaktionerna upphörde efter 10 min på att lägga 12 ìl av 500 mM EDTA. 6. Rening och koncentrationen av radioaktivt märkt DNA-produkter utfördes enligt följande: Kulorna (från ovan) var kokt efter reaktion avslutades i syfte att ta bort DNA från pärlor. Eventuella kvarvarande DNA som kvarblir bifogas pärlor togs bort genom att behandla det pärlor med proteinas K i en volym av 10 ul i 30 minuter vid 50 ° C. Kulorna var sedan kokas och supernatanten togs bort genom magnetisk separation. Den kombinerade supernatanten innehållande DNA renas med hjälp av Qiagen PCR Cleanup kit. Renat radioaktivt märkt DNA-produkter sedan har analyserats i en alkalisk agarosgel. * Replikering i avsaknad av ett huvud-på RNAP stannade töjning komplex utfördes som ovan, men σ 70 utelämnats. Representativa resultat: Kollision av replisome med ett huvud-på RNAP oftast resulterar i två produkter på 2,5 kb och 3,6 kb i längd. Den 2,5 kb produkt är längden på DNA från gaffeln till stoppats RNAP och resultat från replisome stannat vid kollision med RNAP. Den 3,6 kb Produkten representerar full längd DNA och resultat från antingen ofullständig beläggning arrangören av RNAP eller delvis replisome genomläsning av huvudet-på RNAP. En bra eller korrekt resultat visar att ca 50% full längd DNA produceras. Men i vissa fall mindre beläggning arrangören av RNAP inträffar och en högre andel av full längd DNA följs eftersom en större population av replisomes möter inte en head-on RNAP. Replikering i avsaknad av ett stoppades RNAP resultat bara full längd DNA (3,6 kb). Figur. 1 Den replisome hämmas av ett huvud-på RNAP. (A) experiment. En E. colJag RNAP stannade töjning komplex var monterad på en biotinylerad DNA innehåller T7A1 promotor som tidigare beskrivits (9). Kortfattat var ett stoppades förlängning komplex bildas 20 bps nedströms från arrangören genom inkubering RNAP holoenzyme med biotinylerad DNA i 10 minuter följt av tillsats av APU, GTP, ATP och CTP i ytterligare 10 min. Streptavidin pärlor lades ytterligare 10 min sedan kulorna spolades fem gånger med vardera 0,9 ml buffert som innehåller 0,75 m NaCl, 200 mg / ml heparin och 100 nM enda DNA för att ta bort instabil RNAP-DNA-komplex och överskott NTPs . Det DNA var då kokas med Sapi, tvättade och knyts ihop till en i förväg glödgat kluven DNA. Kulorna spolades igen före monteringen av replisome. Arrangören ligger 2,5 kb från gaffeln och är inriktad på direkt transkription mot gaffeln. (B) DnaB lades då replisome var församlad och replikering inleddes antingen i närvaro (Lane 2) eller frånvaron (Lane 1) av en rakt på RNAP.