MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode
Summary
Deze video toont de voorbereiding van een ultra-dunne matrix / analyt laag voor het analyseren van peptiden en eiwitten door Matrix-assisted laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS).
Abstract
Deze video toont de voorbereiding van een ultra-dunne matrix / analyt laag voor het analyseren van peptiden en eiwitten door Matrix-assisted laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS) 1, 2. De ultra-dunne laag methode betreft de productie van een substraatlaag van matrix kristallen (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic zuur) op het monster plaat, die dienst doet als een seeding grond voor verdere kristallisatie van een matrix / analyt mengsel. Voordelen van de ultra-dunne laag methode ten opzichte van andere sample depositie benaderingen (bijv. gedroogde druppel) zijn die het biedt (i) een grotere tolerantie voor verontreinigingen zoals zouten en wasmiddelen, (ii) een betere resolutie, en (iii) hogere ruimtelijke uniformiteit. Deze methode is vooral handig voor de nauwkeurige bepaling van de massa van eiwitten. Het protocol werd in eerste instantie ontwikkeld en geoptimaliseerd voor de analyse van membraaneiwitten en worden gebruikt om met succes te analyseren ion kanalen, metaboliet vervoerders, en receptoren, die tussen 2 en 12 transmembraan-domeinen 2. Sinds de oorspronkelijke publicatie, is het ook aangetoond dat het ook nuttig zijn voor de analyse van oplosbare eiwitten. Inderdaad, we hebben het gebruikt voor een groot aantal eiwitten met een breed scala aan eigenschappen, waaronder die met moleculaire massa's zo hoog als 380 kDa 3. Het is op dit moment onze methode van keuze voor de moleculaire massa analyse van alle eiwitten. De beschreven procedure een constant hoge kwaliteit spectra, en het is gevoelig, robuust en eenvoudig te implementeren.
Protocol
Materials
It is critical that all reagents are of highest-quality (e.g. HPLC-grade).
Powder-free gloves (latex or nitrile)
Stainless steel or gold MALDI sample plate
Methanol (MeOH)
Water
Kimwipes
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-HCCA)
Trifluoroacetic acid (TFA) (final concentration in 0.1% in H2O)
Acetonitrile (ACN)
Formic acid
Isopropanol
References
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
