MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato
Summary
Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l'analisi dei peptidi e proteine da Matrix-Assisted Laser ionizzazione di desorbimento spettrometria di massa (MALDI-MS).
Abstract
Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l'analisi dei peptidi e proteine da Matrix-Assisted Laser Spettrometria di Massa desorbimento ionizzazione (MALDI-MS) 1, 2. L'ultra-sottile strato metodo comporta la produzione di un substrato di cristalli di matrice (alfa-ciano-4-acido idrossicinnamici) sulla piastra del campione, che serve come terreno per la semina successiva cristallizzazione di una matrice / analita miscela. I vantaggi del metodo ultra-sottile strato rispetto ad altri approcci deposizione del campione (ad esempio delle gocce essiccate) sono che offre (i) maggiore tolleranza alle impurità come i sali e detergenti, (ii) la migliore risoluzione, e (iii) maggiore uniformità spaziale. Questo metodo è particolarmente utile per la determinazione della massa accurata delle proteine. Il protocollo è stato inizialmente sviluppato ed ottimizzato per l'analisi delle proteine di membrana e utilizzato per analizzare con successo i canali ionici, trasportatori metabolita, e recettori, contenente tra 2 e 12 domini transmembrana 2. Dopo la pubblicazione originale, ma ha anche dimostrato di essere ugualmente utile per l'analisi di proteine solubili. Anzi, lo abbiamo usato per un gran numero di proteine che hanno una vasta gamma di proprietà, compresi quelli con peso molecolare alto come 380 kDa 3. Oggi è il nostro metodo di scelta per l'analisi molecolare di massa di tutte le proteine. La procedura descritta produce costantemente spettri di alta qualità, ed è sensibile, robusto e facile da implementare.
Protocol
Materials
It is critical that all reagents are of highest-quality (e.g. HPLC-grade).
Powder-free gloves (latex or nitrile)
Stainless steel or gold MALDI sample plate
Methanol (MeOH)
Water
Kimwipes
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-HCCA)
Trifluoroacetic acid (TFA) (final concentration in 0.1% in H2O)
Acetonitrile (ACN)
Formic acid
Isopropanol
References
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
