MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод
Summary
Это видео демонстрирует подготовку ультратонкие матрицы / анализируемого слоя для анализа пептидов и белков Matrix-активированная лазерная десорбция ионизации масс-спектрометрии (MALDI-MS).
Abstract
Это видео демонстрирует подготовку ультратонкие матрицы / анализируемого слоя для анализа пептидов и белков Matrix-активированная лазерная десорбция ионизации масс-спектрометрии (MALDI-MS) 1, 2. Ультра-тонкий слой метод включает в себя производство подложки слоем кристаллов матрицы (альфа-циано-4-гидроксикоричных кислота) на образец пластина, которая служит посевом почву для последующей кристаллизации матрицы / аналита смеси. Преимущества ультра-тонкий слой метода по сравнению с другими образец осаждения подходы (например, сухой капли) в том, что он предоставляет (я) большей терпимости к примесей, таких, как соли и моющих средств, (II), более высокое разрешение, и (III), более высоким пространственным единообразия. Этот метод особенно полезен для точного определения массы белков. Протокол был изначально разработан и оптимизирован для анализа мембранных белков и успешно использованы для анализа ионных каналов, метаболит транспортеры, и рецепторы, содержащие от 2 до 12 трансмембранных доменов 2. С первоначальной публикации, он также показал, в равной степени полезны для анализа растворимых белков. Действительно, мы использовали его для большого количества белков, имеющих широкий спектр свойств, в том числе с молекулярной массой выше, чем 380 кДа 3. Текущее время наш метод выбора для молекулярного анализа масса всех белков. Описанная процедура последовательно производит высококачественные спектры, и она чувствительна, надежный и простой в реализации.
Protocol
Materials
It is critical that all reagents are of highest-quality (e.g. HPLC-grade).
Powder-free gloves (latex or nitrile)
Stainless steel or gold MALDI sample plate
Methanol (MeOH)
Water
Kimwipes
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-HCCA)
Trifluoroacetic acid (TFA) (final concentration in 0.1% in H2O)
Acetonitrile (ACN)
Formic acid
Isopropanol
References
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
