MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

Summary

Denna video visar att förbereda en ultratunn matris / analyt lagret för att analysera peptider och proteiner av Matrix-assisterad laser desorption Ionization masspektrometri (MALDI-MS).

Abstract

Denna video visar att förbereda en ultratunn matris / analyt lagret för att analysera peptider och proteiner av Matrix-assisterad laser desorption Ionization masspektrometri (MALDI-MS) ^{1, 2.} Den ultra-tunna skikt metoden innebär produktion av ett substrat lager av matris kristaller (alfa-cyano-4-hydroxycinnamic acid) på provet plattan, som fungerar som en seedning grund för efterföljande kristallisation av en matris / analyt blandning. Fördelar med ultra-tunna skikt metod under andra metoder prov nedfall (t ex torkad droppe) är att det ger (i) en större tolerans mot föroreningar som salter och rengöringsmedel, (ii) bättre upplösning, och (iii) högre spatial enhetlighet. Denna metod är speciellt användbar för noggrann bestämning av massan av proteiner. Protokollet utvecklades från början och optimerad för analys av membranproteiner och används för att framgångsrikt analysera jonkanaler, metabolit transportörer och receptorer, som innehåller mellan 2 och 12 transmembrane domäner ^2. Sedan den ursprungliga publiceringen, har det också visat sig vara lika användbart för analys av lösliga proteiner. Vi har faktiskt använt den för ett stort antal proteiner som har ett brett utbud av fastigheter, inklusive de med molekylära massorna så hög som 380 kDa ^3. Det är för närvarande vår metod för val för molekylmassa analys av alla proteiner. Det beskrivna förfarandet ger konsekvent hög kvalitet spektra, och det är känsligt, robust och lätt att genomföra.

Protocol

Det är mycket viktigt att bära puderfria handskar under utarbetandet av den tunna skikt. Rengöring av provet plattan Använd en rostfri eller guld MALDI prov plattan. Tvätta med MeOH och torka försiktigt med en Kimwipe. Gnugga inte eller skrubba ytan med Kimwipe, för att förhindra repor på ytan. Tvätta med H 2 O och torka försiktigt med en Kimwipe. Tvätta med MeOH och torka försiktigt med en Kimwipe. Vid behov, upprepa MeO…

Materials

It is critical that all reagents are of highest-quality (e.g. HPLC-grade).

Powder-free gloves (latex or nitrile)
Stainless steel or gold MALDI sample plate
Methanol (MeOH)
Water
Kimwipes
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-HCCA)
Trifluoroacetic acid (TFA) (final concentration in 0.1% in H₂O)
Acetonitrile (ACN)
Formic acid
Isopropanol