Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em
Summary
Die molekulare Basis der räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen wird untersucht mit Hilfe von transgenen Pflanzen, die Gewebe-und Organ-spezifische Phytochrom Mängel aufweisen. Die Isolierung von spezifischen Zellen mit induzierter Phytochrom-Chromophor Abreicherung durch Fluorescence-Activated Cell Sorting gefolgt von Microarray-Analysen wird genutzt, um Gene in räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen beteiligt sind.
Abstract
Licht vermittelt eine Reihe von Entwicklungs-und adaptive Prozesse über den gesamten Lebenszyklus einer Anlage. Pflanzen nutzen Licht absorbierende Moleküle, so genannte Photorezeptoren zu spüren und sich an Licht. Die rot / Dunkelrot-Licht-absorbierenden Photorezeptoren Phytochrom wurden umfassend untersucht. Phytochrome existieren als eine Familie von Proteinen mit unterschiedlichen und sich überschneidenden Funktionen in allen höheren Pflanzen, in denen sie studiert haben,<sup> 1</sup>. Phytochrom-vermittelten Reaktionen Licht, das von Keimung der Samen durch blühende und Seneszenz-Bereich, sind oft auf bestimmte pflanzliche Gewebe oder Organen lokalisiert<sup> 2</sup>. Trotz der Entdeckung und Aufklärung der individuellen und redundant Phytochrom Funktionen durch Mutationsanalysen, aussagekräftige Berichte auf unterschiedlichen Seiten des photoperception und die molekularen Mechanismen der lokalen Pools von Phytochrome, die vermitteln, räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen begrenzt sind. Wir haben Experimente auf der Hypothese, dass bestimmte Websites von Phytochrom photoperception regulieren Gewebe-und Organ-spezifische Aspekte der Photomorphogenese und die lokalisierte Phytochrom Pools engagieren verschiedene Teilmengen von nachgeschalteten Zielgene in Zell-Zell-Signal basiert. Wir entwickelten ein biochemischer Ansatz zur selektiven Reduktion funktioneller Phytochrome in einem Organ-oder Gewebe-spezifische Weise in transgenen Pflanzen. Unsere Untersuchungen basieren auf einem bipartiten Enhancer-trap Ansatz, der in Transaktivierung der Expression eines Gens unter der Kontrolle des Upstream Activation Sequence (UAS) Element Ergebnisse der Transkriptionsaktivator GAL4 Basis<sup> 3</sup>. Das Biliverdin-Reduktase (<em> BVR</em>)-Gen unter die Kontrolle der UAS wird stillschweigend in der Abwesenheit von GAL4 Transaktivierung in der FH-BVR Elternteil aufrechterhalten<sup> 4</sup>. Genetische Kreuzungen zwischen einem UAS-BVR transgene Linie und ein GAL4-GFP-Enhancer trap line führen zu spezifischen Ausdruck der<em> BVR</em> Gen in Zellen gekennzeichnet durch<em> GFP</em> Ausdruck<sup> 4</sup>. BVR Akkumulation in Arabidopsis-Pflanzen führt Phytochrom-Chromophor-Mangel<em> In planta</em<sup> 5-7</sup>. So sind transgene Pflanzen, die wir haben, zeigen GAL4-abhängige Aktivierung der produzierten<em> BVR</em> Gen, was in der biochemischen Inaktivierung von Phytochrom sowie GAL4-abhängigen<em> GFP</em> Ausdruck. Photobiologische und molekulargenetische Analysen<em> BVR</em> Transgenen Linien sind nachgiebig Einblick in Gewebe-und Organ-spezifische Phytochrom-vermittelten Reaktionen, die mit entsprechenden Stellen des photoperception in Verbindung gebracht wurden<sup> 4, 7, 8</sup>. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) von GFP-positive, Enhancer-trap-induzierte<em> BVR</em>-Exprimierenden Pflanzenprotoplasten mit Zelltyp-spezifische Gene Expression Profiling durch Microarray-Analyse gekoppelt wird verwendet, um vermeintliche nachgeschaltete Zielgene bei der Vermittlung von räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen beteiligt sind. Diese Forschung baut unser Verständnis von Seiten der Lichtwahrnehmung, die Mechanismen, durch die verschiedenen Gewebe oder Organe in Licht-regulierte Pflanzenwachstums und der Entwicklung zusammenarbeiten und die Weiterentwicklung der molekularen Zergliederung komplexer Phytochrom-vermittelten Zell-Zell-Signalkaskaden.
Protocol
Discussion
Gene Expression Profiling durch Mikroarrays (1) hat angedeutet, dass mehr als 30% der Gene in Arabidopsis-Keimlinge Licht reguliert 11 sind und (2) hat eine große Gruppe von Genen, Licht Signaltransduktionsproteine in der Phytochrom Signalkaskade 12, 13 beteiligten identifiziert . Solche Experimente deuten darauf hin, dass Licht eine schnelle und langfristige Veränderungen in der Genexpression induziert. Jeder Pool von Phytochrome kann die Kontrolle nur eine Teilmenge der Entwicklungs-und A…
Acknowledgements
Die Arbeit in der Montgomery-Labor auf Phytochrom Reaktionen in Pflanzen wird durch die National Science Foundation (Grant No. MCB-0919100 bis BLM) und der Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of unterstützt Energy (Grant No. DE FG02 91ER20021 zu BLM). Wir danken Melissa Whitaker für die technische Unterstützung während der Dreharbeiten und kritische Durchsicht des Manuskripts, Stephanie Costigan für experimentelle Mitarbeit, Dr. Louis King für die Unterstützung bei der Entwicklung und Optimierung Fluorescence-Activated Cell Sorting Protokolle für Arabidopsis Protoplasten Sortierung und Dr. Melinda Rahmen für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie. Wir bedanken uns bei Marlene Cameron für die grafische Gestaltung Unterstützung und Karen Vogel für redaktionelle Unterstützung.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anti-BVR antibody | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | ||
| Cellulase “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | MSPC 0930 | ||
| Gamborg’s B5 basal salt mixture | Sigma | G5768 | ||
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | PTC 001 | ||
| MES, low moisture content | Sigma | M3671 | ||
| Murashige and Skoog salts | Caisson Laboratories | 74904 | ||
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | ||
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
References
- Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
- Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
- Laplaze, L. GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).
- Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana. , .
- Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell. , 675-688 (1997).
- Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis. Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).
- Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana. , .
- Denecke, J., Vitale, A. The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system. Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).
- Birnbaum, K. Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines. Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).
- Ma, L. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).
- Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).
- Ulm, R., &, N. a. g. y., F, . Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).
- Ma, L. Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).
- Neff, M. M., Fankhauser, C., &, C. h. o. r. y., J, . Light: an indicator of time and place. Genes Dev. 14, 257-271 (2000).
- Birnbaum, K. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
