חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em
Summary
הבסיס המולקולרי של מרחבי ספציפי התגובות phytochrome נחקרת באמצעות הצמחים הטרנסגניים כי התערוכה רקמות איברים ספציפיים ליקויים phytochrome. הבידוד של תאים ספציפיים מציג המושרה דלדול chromophore phytochrome על ידי תא הקרינה המופעל מיון ואחריו מנתח microarray הוא מנוצל כדי לזהות גנים המעורבים מרחבית ספציפית התגובות phytochrome.
Abstract
מתווכת אור מערך של תהליכים התפתחותיים אדפטיבית לאורך כל מחזור החיים של צמח. צמחים לנצל אור קליטת מולקולות בשם photoreceptors לחוש ולהתאים לאור. אדום / מרחיקות אדום אור קליטת photoreceptors phytochrome נחקרו רבות. Phytochromes להתקיים כמשפחה עם פונקציות של חלבונים שונים וחופפים בכל המערכות צמח גבוה שבו הם נחקרו<sup> 1</sup>. Phytochrome בתיווך התגובות אור, אשר נע בין נביטת הזרעים דרך פריחה הזדקנות, הם לעתים קרובות מקומי לרקמות צמחים או איברים ספציפיים<sup> 2</sup>. למרות גילוי הבהרה של פונקציות phytochrome הפרט מיותר מוטציוני באמצעות ניתוחים, דוחות חותכת באתרים שונים של photoperception ואת המנגנונים המולקולריים של בריכות מקומי של phytochromes כי לתווך מרחבית ספציפית התגובות phytochrome מוגבלים. עיצבנו הניסויים מבוסס על השערות כי אתרים ספציפיים של photoperception phytochrome להסדיר רקמות איברים ספציפיים ההיבטים של photomorphogenesis, וכי בריכות phytochrome מקומית לעסוק תת ברורים של גני מטרה במורד הזרם איתות התא אל התא. פיתחנו גישה ביוכימית סלקטיבי להפחית phytochromes פונקציונלי של איבר או רקמה ספציפית בצורה בתוך הצמחים הטרנסגניים. המחקרים שלנו מבוססים על גישה, משפר מלכודת bipartite כי התוצאות transactivation הביטוי של הגן תחת שליטה של האלמנט Upstream רצף (כטב"מ) הפעלה על ידי activator תעתיק GAL4<sup> 3</sup>. Biliverdin רדוקטאז (<em> BVR</em>) הגן תחת שליטתו של כטב"מים נשמר בשקט בהעדר transactivation GAL4 ב הורה כטב"מ-BVR<sup> 4</sup>. חוצה גנטי בין קו מהונדס כטב"מ-BVR ו GAL4-GFP קו משפר מלכודת לגרום הביטוי הספציפי של<em> BVR</em> גנים בתאים מסומנים<em> GFP</em> ביטוי<sup> 4</sup>. BVR הצטברות בתוצאות צמחי ארבידופסיס על מחסור chromophore phytochrome<em> ב Planta</em<sup> 5-7</sup>. לכן, הצמחים הטרנסגניים כי הפקנו GAL4 תלויי התערוכה ההפעלה של<em> BVR</emהגן>, וכתוצאה מכך איון ביוכימי של phytochrome, כמו גם GAL4 תלויי<em> GFP</em> הביטוי. ניתוח גנטי Photobiological מולקולרית של<em> BVR</em> קווי מהונדס הם מניבים תובנה רקמות איברים ספציפיים phytochrome בתיווך תגובות קושרו עם אתרי המקביל photoperception<sup> 4, 7, 8</sup>. מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS) של ה-GFP חיובי, משפר, מלכודת-Induced<em> BVR</em>-לבטא protoplasts צמח יחד עם פרופיל תא מסוג ספציפי גן ביטוי באמצעות ניתוח microarray נמצא בשימוש כדי לזהות המשוערת גני מטרה במורד הזרם מעורב בתיווך מרחבית ספציפית התגובות phytochrome. מחקר זה מרחיב את ההבנה שלנו של אתרי תפיסת האור, את המנגנונים שבאמצעותם רקמות או איברים שונים לשתף פעולה צמיחה אור מוסדר צמח ופיתוח, קידום לנתיחה מולקולרית של phytochrome בתיווך מורכב תא אל תא האיתות מפלי.
Protocol
Discussion
התבטאות גנים באמצעות פרופיל microarrays (1) ציין כי יותר מ -30% מכלל הגנים שתילים ארבידופסיס הם 11 מוסדר אור (2) זיהה קבוצה המכריע של הגנים המקודדים חלבונים אור הולכת אותות מעורבים phytochrome איתות מפל 12, 13 . ניסויים אלה מראים כי האור גורם לשינויים מהירים לטווח ארוך ביטוי…
Acknowledgements
עבודה במעבדה מונטגומרי על התגובות phytochrome בצמחים נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק לא. MCB-0919100 כדי BLM) ומדעי כימית, Geosciences ו Biosciences החטיבה, משרד האנרגיה של יסוד מדעי, משרד המדע, משרד החוץ האמריקני אנרגיה (ללא מענק. DE FG02 91ER20021 כדי BLM). אנו מודים מליסה ויטאקר לקבלת סיוע טכני במהלך הצילומים אנושות בקריאת כתב היד, סטפני קוסטיגן לסיוע הניסוי, ד"ר לואיס המלך לסיוע בפיתוח ואופטימיזציה הקרינה המופעל Cell מיון פרוטוקולים למיון protoplast ארבידופסיס מסגרת ד"ר מלינדה לסיוע עם confocal במיקרוסקופ. אנו מודים מרלן קמרון לסיוע עיצוב גרפי בירד קרן לסיוע העריכה.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anti-BVR antibody | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | ||
| Cellulase “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | MSPC 0930 | ||
| Gamborg’s B5 basal salt mixture | Sigma | G5768 | ||
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | PTC 001 | ||
| MES, low moisture content | Sigma | M3671 | ||
| Murashige and Skoog salts | Caisson Laboratories | 74904 | ||
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | ||
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
References
- Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
- Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
- Laplaze, L. GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).
- Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana. , .
- Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell. , 675-688 (1997).
- Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis. Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).
- Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana. , .
- Denecke, J., Vitale, A. The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system. Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).
- Birnbaum, K. Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines. Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).
- Ma, L. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).
- Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).
- Ulm, R., &, N. a. g. y., F, . Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).
- Ma, L. Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).
- Neff, M. M., Fankhauser, C., &, C. h. o. r. y., J, . Light: an indicator of time and place. Genes Dev. 14, 257-271 (2000).
- Birnbaum, K. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
