Indagare tessuti e risposte fitocromo organo-specifici utilizzando FACS-Cell-assistita di tipo profili specifici di espressione in Arabidopsis thaliana</em
Summary
Le basi molecolari delle risposte fitocromo spazio-specifica è indagato con le piante transgeniche che presentano tessuti e carenze fitocromo organo-specifiche. L'isolamento di cellule specifiche esporre indotte esaurimento fitocromo cromoforo da Fluorescence-Activated cella Ordinamento seguita da analisi di microarray viene utilizzata per identificare i geni coinvolti nello spazio-risposte specifiche fitocromo.
Abstract
Media luce una serie di processi evolutivi e adattativi per tutto il ciclo di vita di una pianta. Le piante utilizzano la luce di assorbimento delle molecole chiamate fotorecettori di senso e di adattarsi alla luce. Il rosso / lontano-rosso che assorbono la luce fotorecettori fitocromo sono stati studiati ampiamente. Fitocromi esistere come una famiglia di proteine con funzioni diverse e sovrapposte in tutti i sistemi vegetali superiori in cui sono stati studiati<sup> 1</sup>. Fitocromo-mediata risposte luce, che vanno dalla germinazione del seme attraverso la fioritura e la senescenza, sono spesso localizzate a specifici tessuti vegetali o organi<sup> 2</sup>. Nonostante la scoperta e la spiegazione delle funzioni individuali e fitocromo in esubero mediante analisi mutazionale, report conclusivi su siti distinti photoperception e dei meccanismi molecolari di piscine localizzata di fitocromi che mediano le risposte fitocromo spazio-specifici sono limitati. Abbiamo progettato esperimenti basati su ipotesi che i siti specifici di photoperception fitocromo regolano tessuti e organi specifici aspetti della fotomorfogenesi, e che le piscine localizzato fitocromo impegnarsi distinti sottoinsiemi di geni bersaglio a valle in cellula-segnalazione cellulare. Abbiamo sviluppato un approccio biochimico per ridurre selettivamente fitocromi funzionale in un organo o tessuto-specifica all'interno di piante transgeniche. I nostri studi si basano su un bipartito enhancer-trap approccio che si traduce in transattivazione dell'espressione di un gene sotto il controllo della sequenza di attivazione a monte (UAS) elemento dal attivatore trascrizionale GAL4<sup> 3</sup>. La biliverdina reduttasi (<em> BVR</em> Gene) sotto il controllo delle scuole universitarie professionali è mantenuto in silenzio, in assenza di GAL4 transattivazione nella UAS-BVR genitore<sup> 4</sup>. Incroci genetici tra un UAS-BVR linea transgenica e un GAL4-GFP risultato trappola enhancer linea in un'espressione specifica del<em> BVR</emGene> nelle cellule segnato da<em> GFP</em> Espressione<sup> 4</sup>. Accumulo BVR in Arabidopsis risultati piante in carenza cromoforo fitocromo<em> In planta</em<sup> 5-7</sup>. Così, piante transgeniche che abbiamo prodotto mostra GAL4-dipendente l'attivazione del<em> BVR</em> Gene, con conseguente inattivazione della biochimica fitocromo, così come GAL4-dipendente<em> GFP</em> Espressione. Fotobiologiche analisi genetiche e molecolari<em> BVR</em> Linee transgeniche stanno dando comprensione tessuto e organo-specifiche fitocromo-mediata risposte che sono state associate con siti corrispondenti di photoperception<sup> 4, 7, 8</sup>. Fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) di GFP-positive, enhancer-trap-indotta<em> BVR</em> Che esprimono protoplasti impianto accoppiato con cellula-tipo-specifici profili di espressione genica attraverso l'analisi microarray viene utilizzato per identificare i putativi geni target a valle coinvolti nella mediazione risposte fitocromo spazio-specifiche. Questa ricerca sta ampliando la nostra comprensione dei siti di percezione della luce, i meccanismi attraverso i quali diversi tessuti o organi cooperare in luce regolata la crescita delle piante e lo sviluppo, e avanzando la dissezione molecolare dei complessi fitocromo-mediata cellula-cellula cascate di segnalazione.
Protocol
Discussion
Profili di espressione genica attraverso microarray (1) ha indicato che oltre il 30% dei geni in piantine di Arabidopsis sono regolati luce 11 e (2) ha identificato un vasto gruppo di geni che codificano le proteine luce di trasduzione del segnale coinvolte nella cascata di segnalazione fitocromo 12, 13 . Tali esperimenti suggeriscono che la luce induce cambiamenti rapidi e lungo termine espressione genica. Ogni pool di fitocromi può controllare solo un sottoinsieme di risposte di sviluppo e…
Acknowledgements
Lavoro in laboratorio Montgomery sulle risposte fitocromo nelle piante è sostenuta dalla National Science Foundation (non concede. MCB-0919100 per BLM) e Scienze Chimiche, Scienze geologiche e Bioscienze Divisione, Ufficio di Basic Sciences Energy, Office of Science, US Department of energia (non concedere alcuna. DE FG02 91ER20021 a BLM). Ringraziamo Melissa Whitaker per l'assistenza tecnica durante le riprese e la lettura critica del manoscritto, Stephanie Costigan sperimentale per l'assistenza, il Dott. Luigi Re di assistenza sviluppare e ottimizzare le Fluorescence-Activated cella ordinamento protocolli per l'ordinamento di protoplasti di Arabidopsis e il Dr. Telaio Melinda per assistenza confocale microscopia. Ringraziamo Marlene Cameron per l'assistenza di progettazione grafica e Bird Karen per l'assistenza editoriale.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anti-BVR antibody | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | ||
| Cellulase “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | MSPC 0930 | ||
| Gamborg’s B5 basal salt mixture | Sigma | G5768 | ||
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | PTC 001 | ||
| MES, low moisture content | Sigma | M3671 | ||
| Murashige and Skoog salts | Caisson Laboratories | 74904 | ||
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | ||
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
References
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