Estrazione del DNA da microbi intestinali della Termite (Zootermopsis Angusticollis) e visualizzare microbi intestinali

Summary

Questo video illustra la tecnica per estrarre il DNA dalla specie di microbi residenti nel hindgut termite. La preparazione di un vetrino a fresco, che è utile per visualizzare la comunità microbica intestinale è anche illustrato, e un tour attraverso le specie di ambiente ricco di intestino è dato.

Abstract

Le termiti sono tra i pochi animali noti per avere la capacità di sussistere esclusivamente da legno consumando. Il tratto intestinale termite contiene una popolazione microbica densi e ricchi di specie che assiste nella degradazione della lignocellulosa prevalentemente in acetato, la sostanza nutriente chiave alimentando il metabolismo delle termiti (Odelson & Breznak, 1983). All'interno di queste popolazioni microbiche sono batteri, archeobatteri metanogeni e, in alcuni ("inferiore") termiti, eucarioti protozoi. Così, le termiti sono i soggetti di ricerca di eccellenza per lo studio delle interazioni tra le specie microbiche e le numerose funzioni biochimiche che svolgono a beneficio della loro ospite. La composizione delle specie delle popolazioni microbiche in budella delle termiti così come i geni chiave coinvolti in vari processi biochimici è stata esplorata mediante tecniche molecolari (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Queste tecniche dipendono dalla estrazione e purificazione degli acidi nucleici di elevata qualità dall'ambiente intestinale termite. La tecnica di estrazione descritta in questo video è una raccolta modificata di protocolli sviluppati per l'estrazione e la purificazione degli acidi nucleici da campioni ambientali (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) e produce DNA da materiale hindgut termite può essere utilizzato come modello per la reazione a catena della polimerasi (PCR).

Protocol

Sintesi procedurale per tutta la termite-gut estrazione del DNA: Termiti freddo sul ghiaccio, rimuovere intestino utilizzando una pinzetta sterile e stabilizzare i campioni di intestino nel buffer. Omogeneizzare i campioni in PVPP / SDS / buffer fenolo. Estrarre e purificare il DNA da lisato grezzo con colonne Qiagen DNeasy. Protocollo: Sul ghiaccio, rimuovere il fegato dalle termiti casta…

Discussion

Nella nostra esperienza, il DNA estratto dalle comunità microbiche del legno al seno specie di termiti come nevadensis Zootermopis è sufficientemente puro per il modello PCR dopo un giro di estrazione e purificazione. Tuttavia, alcuni termiti come lettiera al seno e il terreno al seno specie può avere una maggiore concentrazione di acidi umici nel loro contenuto intestinale e può richiedere ulteriore purificazione di DNA microbico intestinale. La resa del DNA totale dalle viscere di 5 lavoratori nevadensis Z. è nel range di 10-30 mg. P…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PVPP/SDS/phenol	Buffer			homogeneization buffer
DNeasy Tissue Kit	Kit	Qiagen	77607	Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003)
TE	Buffer	Sigma	T9285	1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate
zirconia/silica beads	Supplies	BioSpec Products	11079101z	0.1 mm
PVPP	Reagent	Sigma	P6755	1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer
Zootermopsis nevadensis	Animal			Termites
SDS	Reagent	Sigma	L4390	Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent
Phenol	Reagent	Sigma	77607	TE-saturated, ~73%
MiniBeadbeater-8	Tool	BioSpec Products	963
BSS	Buffered Salt Solution, pH 7.2			Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1M soln. of NaHCO3
AxioPlan-2	Microscope	Carl Zeiss, Inc. USA		Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination