Denna video visar en teknik för att extrahera DNA från de arter av mikrober bosatt i termit hindgut. Beredningen av en våt montera bild, vilket är användbart för att visualisera samhället tarmen mikrobiella illustreras också, och en tur genom artrika gut miljö ges.
Termiter är bland de få djur som är kända för att ha kapacitet att överleva enbart genom att konsumera trä. Den termit tarmen tarmkanalen innehåller en tät och artrik mikrobiell population som hjälper nedbrytningen av lignocellulosa främst i acetat, den viktigaste näringsämne bränslepåfyllning termit metabolism (Odelson & Breznak, 1983). Inom dessa mikrobiella populationer är bakterier, metanbildande arkéer och i vissa ("lägre") termiter, eukaryota protozoer. Således termiter är utmärkta försökspersoner för att studera samspelet mellan mikroorganismer och de många biokemiska funktioner de utför till förmån för sin värd. Artsammansättningen av mikrobiella populationer i termit tarmar samt viktiga gener som är involverade i olika biokemiska processer har undersökts med hjälp av molekylära tekniker (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Dessa tekniker är beroende av utvinning och rening av hög kvalitet nukleinsyror från termiter tarmen miljö. Utvinning teknik som beskrivs i den här videon är en modifierad sammanställning av protokoll som utvecklats för extraktion och rening av nukleinsyror från miljöprover (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) och det ger DNA från termiter hindgut material som lämpar sig för användning som mall för polymeraskedjereaktion (PCR).
Enligt vår erfarenhet är DNA ur mikrobiella samhällen i trä-utfodring termit arter som Zootermopis nevadensis tillräckligt rent för PCR-mall efter en runda av extraktion och rening. Dock kan vissa termiter som skräp-matning och jord-matning arter har en högre koncentration av humus i tarmen innehåll och kan kräva ytterligare rening av tarmen mikrobiella DNA. Den totala DNA avkastningen från inälvor av 5 Z. nevadensis arbetstagare är i intervallet 10-30 mikrogram. För termit arter betydligt mindre eller större än denna art, k…
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
PVPP/SDS/phenol | Buffer | homogeneization buffer | ||
DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003) |
TE | Buffer | Sigma | T9285 | 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate |
zirconia/silica beads | Supplies | BioSpec Products | 11079101z | 0.1 mm |
PVPP | Reagent | Sigma | P6755 | 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer |
Zootermopsis nevadensis | Animal | Termites | ||
SDS | Reagent | Sigma | L4390 | Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent |
Phenol | Reagent | Sigma | 77607 | TE-saturated, ~73% |
MiniBeadbeater-8 | Tool | BioSpec Products | 963 | |
BSS | Buffered Salt Solution, pH 7.2 | Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1M soln. of NaHCO3 | ||
AxioPlan-2 | Microscope | Carl Zeiss, Inc. USA | Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination |