में vivo माइक्रो नमूनों सतहों पर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच

Summary

यह वीडियो सूक्ष्म नमूनों सतहों उपयोग करके प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के बाद विश्लेषण के साथ प्रयोगों से पता चलता है. दृष्टिकोण करने के लिए जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन बातचीत का पता लगाने की संभावना प्रदान करता है और संभावना के साथ उच्च throughput क्षमताओं को जोड़ती है मात्रात्मक जानकारी निकालने.

Abstract

अणुओं की बातचीत नेटवर्क Unraveling<em> में इन विवो</em> तंत्र है कि सेल समारोह और चयापचय को विनियमित करने को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. कोशिकाओं में आणविक मुलाकातों को संबोधित करने के लिए पद्धति विकल्पों में से एक भीड़ को विकसित किया गया है, लेकिन इन तरीकों के सबसे जा रहा है बल्कि परोक्ष और इसलिए शायद ही मात्रात्मक से ग्रस्त है. इसके विपरीत कुछ उच्च अंत मात्रात्मक दृष्टिकोण पेश किए गए, जो तथापि उच्च throughput बढ़ाने के लिए मुश्किल हैं. मात्रात्मक जानकारी निकालने की संभावना के साथ उच्च throughput क्षमताओं गठबंधन करने के लिए, हम हाल ही में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए एक नई अवधारणा है (Schwarzenbacher विकसित<em> एट अल</em>, 2008). यहाँ, हम डिजाइन और इस प्रणाली का निर्माण है जो एक fluorophore लेबल प्रोटीन ("शिकार") और एक झिल्ली प्रोटीन के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है ("चारा") के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन<em> में इन विवो</em>. कक्ष micropatterned चारा exoplasmic डोमेन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ functionalized सतहों पर चढ़ाया जाता है. चारा – शिकार बातचीत फ्लोरोसेंट शिकार के पुनर्वितरण के माध्यम से assayed हैं. विधि उच्च संवेदनशीलता एकल अणुओं के स्तर तक नीचे, कमजोर बातचीत का पता लगाने की क्षमता है, और उच्च throughput क्षमता की विशेषता है, यह प्रदर्शन उपकरण के रूप में लागू करने.

Protocol

Microcontact मुद्रण: Micropattern PDMS टिकट के क्षेत्र एक स्केलपेल का उपयोग कर बाहर कट यह इथेनॉल (100%) और आसुत जल के साथ निस्तब्धता द्वारा micropattern युक्त क्षेत्र धो लें. नाइट्रोजन या argon गैस के साथ PDMS स्टांप सूखी. पिपेट 50 μl BSA Cy5 काम (0.67 मिलीग्राम / एमएल) समाधान PDMS स्टांप ताकि पूरे micropattern क्षेत्र समाधान के साथ कवर किया जाता है पर. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. यह फास्फेट के साथ निस्तब्धता द्वारा micropattern क्षेत्र धो खारा (PBS) और आसुत जल buffered. सूखी नाइट्रोजन या argon गैस के साथ PDMS. अपने स्वयं के वजन के तहत एक epoxy लेपित coverslip के बीच पर PDMS स्टांप प्लेस और एक पेट्री डिश में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. Coverslip की पीठ पर PDMS स्टाम्प की स्थिति लेबल और एक संदंश के साथ स्लाइड से स्टांप पट्टी. Coverslip पर microcontact मुद्रित क्षेत्र के ऊपर एक सुरक्षित सील संकरण चैम्बर रहो. लेबल के लिए क्षेत्र के केंद्र स्थानीयकरण मदद करता है. प्रतिक्रिया कक्ष में पिपेट 60 μl streptavidin काम (50 μg / एमएल) समाधान और कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए नमूना सेते हैं. 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ चैम्बर के एक बंदरगाह में बफर जोड़ने और यह एक पंप के साथ दूसरे बंदरगाह पर एक साथ हटाने के द्वारा नमूना धो लें. पिपेट 60 μl biotinylated एंटीबॉडी काम (/ 10 μg मिलीलीटर पीबीएस में 0.1% बीच 20 के साथ पूरक, "PBST") प्रतिक्रिया और कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए चैम्बर सेते समाधान में. 1 मिलीलीटर PBST और बाद में 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ चैम्बर के एक बंदरगाह में बफर जोड़ने और यह एक पंप के साथ दूसरे बंदरगाह पर फिर से हटाने के द्वारा नमूना धो लें. कमरे के तापमान पर अंधेरे में पीबीएस में micropatterned सतहों स्टोर जब तक कोशिकाओं को बोने के लिए तैयार हैं. Micropatterned सतह पर कोशिकाओं के ऊष्मायन: 50% एक 3 सेमी टिशू कल्चर थाली में संगम के अनुयायी कोशिकाओं को विकसित. Ethylenediaminetetraacetic एसिड समाधान (EDTA) के साथ ब्याज की चारा और शिकार प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं को अलग और 1000 rpm पर 5 मिनट अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और अनुसार मध्यम विकास में सेल गोली भंग. १,००० rpm पर 5 मिनट अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और उपयुक्त मध्यम विकास में सेल गोली भंग. पीबीएस विनिमय micropatterned coverslip पर सेल निलंबन के 60 μl द्वारा प्रतिक्रिया कक्ष से. आसुत जल में एक बाँझ पैड भिगोने और यह पेट्री डिश में डाल सूखी चलने से नमूना को रोकने के द्वारा एक humidified कक्ष बनाएँ. 37 पर रात से अधिक कोशिकाओं सेते ° सी micropatterned सतहों पर एक 5% सीओ 2 माहौल में . खुर्दबीन पर कोशिकाओं का विश्लेषण करने से पहले, एस हांक बफर नमक 2 Ca सहित समाधान द्वारा मध्यम विनिमय + और ​​2 मिलीग्राम +. माइक्रोस्कोपी: coverslip एक उपयुक्त माउंट पर रखा गया है और सेल morphology सफेद रोशनी के तहत जाँच की है. BSA Cy5 पैटर्न की गुणवत्ता 647 एनएम उत्तेजना के द्वारा जाँच की है. फ्लोरोसेंट शिकार प्रोटीन (GFP या YFP) के Micropatterns कुल आंतरिक परावर्तन उत्तेजना (TIR) ​​के तहत 488 या 514 एनएम में दर्ज हैं. प्रतिनिधि परिणाम: यदि वहाँ एक micropatterned सतह पर विकसित कोशिकाओं में प्रोटीन लक्ष्य के बीच बातचीत है, शिकार चारा पुनर्वितरण का पालन करेंगे. जिसके परिणामस्वरूप micropattern शिकार प्रोटीन की प्रतिदीप्ति लेबल के द्वारा visualized किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात प्राप्त विपरीत बातचीत ताकत का एक सीधा उपाय प्रदान करता है (चित्रा 1 देखें). आगे मापा प्राथमिक डेटा की प्रक्रिया की आवश्यकता के बिना – इसलिए दो प्रोटीन की बातचीत का एक सरल मूल्यांकन संभव हो जाता है. चित्रा 1 अलग बातचीत ताकत पर लाइव सेल प्लाज्मा झिल्ली में चारा की पुनर्व्यवस्था. TIR T24 CD71-एंटीबॉडी पर (क) CD71-GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की छवियों, (ख) सीडी 4 और सीडी 4 – एंटीबॉडी पर साइटोसोलिक YFP और (ग) CD59 एंटीबॉडी microbiochips पर जीपीआई GFP-DAF दिखाए जाते हैं. डेटा के लिए विशेषता है मजबूत (क), (ख) या कमजोर बातचीत (ग). (क) (Weghuber एट अल, प्रेस में), (ख) से (Schwarzenbacher एट अल., 2008) से reproduced है.

Discussion

साथ वीडियो जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली (Brameshuber एट अल, 2009;. Weghuber एट अल, प्रेस में Schwarzenbacher एट अल, 2008) में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए एक विधि दर्शाता है. सिद्धांत रूप में, किसी भी TIRF आधारित माइक्रोस्कोपी मंच readout प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. केवल जब उच्च संवेदनशीलता (जैसे एकल अणुओं का पता लगाने के लिए) वांछित है, उन्नत सूक्ष्मदर्शी की आवश्यकता होगी. सबसे अच्छा परिणाम तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान निम्न महत्वपूर्ण बिंदुओं को प्राप्त करने के लिए विशेष ध्यान की आवश्यकता होती है:

1. स्टोर अंधेरे शर्तों के तहत Cy5 स्टॉक समाधान की fluorophore विरंजन से बचने के लिए और हौसले BSA – Cy5 काम समाधान microcontact मुद्रण से पहले तैयार है.
2. विंदुक टिप के साथ PDMS पर नहीं micropattern और खरोंच अंधेरे की fluorophore विरंजन से बचने की शर्तों के तहत नमूना सेते हैं सावधान रहो.
3. गिलास स्लाइड के पेट्री डिश करने के लिए चिपके को रोकने के लिए एक बाँझ पैड पर coverslip रखो. एक बार PDMS स्टांप गिलास स्लाइड का पालन किया है, यह चाल नहीं है.
4. प्रतिक्रिया कक्ष में हवाई बुलबुले से बचें और अंधेरे की fluorophore विरंजन से बचने शर्तों के तहत नमूना सेते हैं.
5. अधिक से अधिक 2 मिनट के लिए नमूना शुष्क नमक क्रिस्टल के गठन से बचने मत करो.
6. कक्षों की टुकड़ी के लिए trypsin के रूप में उपयोग नहीं करते हैं यह फोड़ना अब तक व्यक्त की झिल्ली प्रोटीन के कोशिकी डोमेन होगा. Trypsin बचना सतह पर कोशिकाओं की कुर्की के तुरंत बाद micropatterns फार्म कम कारोबार की दर के साथ प्रोटीन के लिए उपयोगी हो जाएगा.
7. एक खुर्दबीन में incubated कोशिकाओं की संख्या पर नियंत्रण और यकीन है कि कोशिकाओं से अधिक 30-50% संगम तक पहुँच नहीं है. सुनिश्चित करें कि अत्यधिक कोशिकाओं तुरंत एंटीबॉडी लेपित सतह पर कोशिकाओं के तेजी से लगाव के कारण हटा रहे हैं.
8. केवल उच्च गुणवत्ता BSA Cy5 पैटर्न के साथ स्लाइड्स के आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
9. फ्लोरोसेंट शिकार प्रोटीन की स्थिर अभिव्यक्ति के कारण कोशिकाओं है कि स्कैन प्रति विश्लेषण किया जा सकता है है की अधिक से अधिक संख्या के लिए बेहतर है.
10. पर्याप्त TIRF समायोजन साइटोसोलिक पृष्ठभूमि के कारण पैटर्न कल्पना करने के लिए अपरिहार्य है.

माइक्रो patterning तकनीक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के विश्लेषण के लिए कई संभावनाएं प्रदान करता है है. सबसे पहले, स्थानीय, spatially हल प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की मात्रा का ठहराव के साथ भी कमजोर या अप्रत्यक्ष रूप से बातचीत का पता लगाने झूठी सकारात्मक या नकारात्मक की एक उच्च संख्या देने के नुकसान के बिना संभव है. दूसरी बात यह शोधकर्ता जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली, जो 2 संकर स्क्रीन की तरह जैव रासायनिक दृष्टिकोण द्वारा हासिल करना मुश्किल है में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण करने के लिए सक्षम बनाता है. तीसरा दृष्टिकोण चारा शिकार बातचीत है कि तापमान, विभिन्न प्रोटीन या अन्य अणुओं या बाद translational संशोधनों की उपस्थिति की तरह पर्यावरण परिवर्तन के द्वारा modulated हैं का पता लगाने के के लिए अनुमति देता है. इस प्रकार परख एक दिया जीवित कोशिकाओं के संदर्भ में बातचीत जोड़ी की स्क्रीनिंग modulators के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा कब्जा ligand या monovalent ligands के उपयोग की सतह के घनत्व को कम करके आराम की स्थिति का विश्लेषण संभव हो जाता है. अंत में, यदि पर्याप्त स्कैनिंग प्लेटफार्मों का उपयोग किया जाता है, विश्लेषण कोशिकाओं की संख्या पर्याप्त उच्च करने के लिए दवा स्क्रीनिंग के लिए दवा कंपनियों के उच्च throughput की मांग (Ramm, 2005) मैच है.