このビデオでは、マイクロパターン化表面を使用することにより、タンパク質 – タンパク質相互作用のその後の分析と実験を示しています。アプローチは、生きた細胞でタンパク質間相互作用を検出する可能性を提供し、定量的な情報を抽出する可能性が高いスループット能力を兼ね備えています。
分子の相互作用のネットワークを解明<em>生体内</em>細胞機能と代謝の制御機構を理解する鍵である。細胞内の分子間相互作用に対処するための方法論的な多数のオプションが開発されたが、これらのメソッドのほとんどは、ほとんど定量的ではなく、間接的、従ってであることに苦しんでされています。逆に、少数のハイエンド定量的アプローチは、しかし、高いスループットに拡張することが困難である、導入されました。定量的な情報を抽出する可能性が高いスループット能力を結合するには、我々は最近、タンパク質間相互作用を識別するための新しいコンセプトを(Schwarzenbacher開発<em>ら</em>。、2008)。ここで、我々はデザインと蛍光標識タンパク質("獲物")と膜タンパク質("餌")との間の相互作用を分析することを可能にするこのシステムの構築のための詳細なプロトコルを記述する<em>生体内</em>。細胞は、餌exoplasmicドメインに対する抗体で機能化マイクロパターン表面上にメッキされています。餌 – 獲物相互作用は、蛍光獲物の再分配を経由してアッセイされる。方法は、スクリーニングツールとしてそれが適用されること、ダウン、単一分子のレベルまで高感度、弱い相互作用を検出する能力、および高いスループット能力によって特徴づけられる。
付属のビデオでは、生きた細胞の血漿膜(。。Brameshuber ら 、2009;。。Weghuber ら 、 印刷中 Schwarzenbacher ら 、2008)におけるタンパク質間相互作用を検出する方法を示しています。原則として、いかなるTIRFベースの顕微鏡のプラットフォームは、読み出しシステムとして使用することができます。高感度は(単一分子の検出用など)が必要なときにのみ、高度な顕微鏡が必要になります。最良の結果を達成するための準備処理中に、次の重要な点は特別な注意が必要です。
マイクロパターニング技術は、タンパク質 – タンパク質相互作用の分析のためのいくつかの可能性を提供しています。まず、ローカル、空間分解タンパク質間相互作用の定量化と一緒にも弱いまたは間接的な相互作用の検出は、偽陽性または陰性の高い数を与えることの欠点なしで可能です。第二にそれは2 – ハイブリッドスクリーンのような生化学的なアプローチによって達成することは困難である生きた細胞の血漿膜にタンパク質間相互作用を分析する研究が可能になります。第三のアプローチは、温度などの環境変化、異なるタンパク質または他の分子や翻訳後修飾の存在によって変調される餌と被食者相互作用の検出が可能になります。したがって、このアッセイは、生細胞のコンテキスト内の指定された相互作用のペアのスクリーニング変調が可能になります。さらに、捕獲リガンドまたは一価のリガンドの使用の面密度を低減することにより、静止状態の解析が可能となる。適切なスキャンのプラットフォームが使用されている場合、最終的には、分析セルの数は、薬物スクリーニングのための製薬企業の高スループット要求(ラム、2005)と一致するのに十分高いです。
The authors have nothing to disclose.
我々はGPI – GFPについては、hCD71 – GFPコンストラクト、及びダニエルLegler、コンスタンツ、スイスの大学のために、彼女の親切な助け、カタリーナシュトループ、ジュネーブ、スイスの大学のためQuentinaビーティ、リンツ、オーストリアの大学を、感謝したいと思います- DAFの構築。と科学研究のためのオーストリア連邦省のGEN – AUのプロジェクト、この作品は、オーストリア科学基金(プロジェクトY250 – B03 FWF)によってサポートされていました。