이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.
분자의 상호 작용 네트워크를 무너지고있다<em>에 – 생체내</em> 세포 기능과 신진 대사를 조절하는 메커니즘을 이해하는 열쇠입니다. 세포의 분자 상호 작용을 해결하기위한 방법 론적 선택의 무리가 개발하지만, 이러한 방법의 대부분은 거의 양적 오히려 간접 따라서되는 고통되었습니다. 반대로, 몇 가지 고급 양적 접근 방법이 도입되었다, 그러나 높은 처리량을 확장하기가 어렵습있는. 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합하기 위해, 우리는 최근에 단백질 단백질 상호 작용을 파악하기위한 새로운 개념을 (Schwarzenbacher 개발<em> 외</em>., 2008). 여기, 우리는 ( "미끼") 형광단 – 라벨 단백질 ( "먹이")와 막 단백질 사이의 상호 작용을 분석하는 허용이 시스템의 설계 및 건설에 대한 자세한 프로토콜을 설명<em>에 – 생체내</em>. 세포는 미끼 exoplasmic 도메인에 대한 항체로 작용 micropatterned 표면에 도금입니다. 미끼 – 먹이 상호 작용은 형광등 먹이의 재배포를 통해 assayed 있습니다. 방법은 선별 도구로 그것이 적용하고, 아래로 단일 분자 수준 높은 감도, 약한 상호 작용을 감지하는 능력, 높은 처리 능력에 의해 특징입니다.
함께 비디오 생활 세포의 플라즈마 – 멤브레인 (.; Brameshuber 외, 2009;.. Weghuber 외, 언론에서 Schwarzenbacher 외, 2008)에서 단백질 – 단백질 상호 작용을 검출하는 방법을 보여줍니다. 원칙적으로, 모든 TIRF 기반 현미경 플랫폼은 판독 시스템으로 사용할 수 있습니다. 높은 감도 (단일 분자의 검출에 대한 예) 원하는 경우에만, 고급 현미경이 필요합니다. 최상의 결과가 준비 과정에서 다음과 같은 중요한 사항을 달성하기 위해서는 특별한주의가 필요합니다 :
마이크로 patterning 기술은 단백질 – 단백질 상호 작용의 분석을위한 몇 가지 가능성을 제공합니다. 첫째, 지역, 공간 해결 단백질 단백질 상호 작용의 부량와 함께 또한 약한 또는 간접적으로 상호 작용의 검출은 잘못된 반응 또는 제외 높은 번호를 부여의 단점없이 가능합니다. 둘째 그것은 2 하이브리드 화면과 같은 생화 학적 방법에 의해 달성하기 어렵습니다 라이브 세포의 플라즈마 막에 단백질 단백질 상호 작용을 분석하기 위해 연구자 수 있습니다. 셋째 방법은 온도, 다른 단백질이나 다른 분자 또는 사후 translational 수정의 존재와 같은 환경 변화에 의해 변조된 아르 미끼 – 먹이 상호 작용의 검출을 허용합니다. 따라서 분석 살 세포의 맥락에서 주어진 상호 작용 쌍 심사 변조기를 허용합니다. 또한 캡처 리간드 또는 monovalent 리간드의 사용의 표면 밀도를 줄임으로써, 휴식 상태의 분석이 가능하게됩니다. 적절한 검색 플랫폼을 사용하는 경우 마지막으로, 분석 세포의 숫자는 약물 검사를위한 제약 회사의 높은 처리량 요구 (램, 2005)와 일치 정도로 높습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 GPI – GFP 들어, hCD71 – GFP 구축, 그리고 다니엘 레글러, 콘스탄츠, 스위스의 대학에 대한 그녀의 친절한 도움 Katharina Strub, 스위스 제네바 대학에 대한 Quentina 비티, 린츠, 오스트리아의 대학, 감사의 말씀을 전합니다 – DAF는 건설. 과학 연구에 대한 오스트리아 연방 교육부의 GEN – AU 프로젝트,이 작품은 오스트리아 과학 기금 (프로젝트 Y250 – B03 FWF)에 의해 지원되었다.