ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞
Summary
初期胚を形成する形態形成のプロセスを理解するための鍵は、高解像度での画像セルにできることです。ここでは、細胞膜をターゲットとする緑色蛍光タンパク質で全体のゼブラフィッシュの胚では細胞の単一細胞または小さなクラスターを標識するためのテクニックを説明します。
Abstract
初期の脊椎動物の胚を形成する形態形成のプロセスを理解するための鍵は、高解像度での画像セルにできることです。ゼブラフィッシュ胚、モザイク式の中のプラスミドDNAの結果の注入は、単一の細胞または細胞の小さなクラスターの可視化を可能に<sup> 1</sup>。我々は、ユビキタスプロモーターの制御下でプラスミドDNAのエンコーディング膜をターゲットとする緑色蛍光タンパク質（MGFP）の注入は神経胚形成を受けているイメージング細胞に使用できる方法について説明します。このプロトコルの中心は、セクションでもリアルタイムで高分解能でイメージング標識された細胞のための方法論です。このプロトコルは、若いゼブラフィッシュ胚にMGFPのDNAの注入を必要とする。胚はその後ビブラトーム切片、抗体標識と共焦点顕微鏡によるイメージングのために処理されます。また、MGFPを表現するライブ胚をタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて画像化することができます。我々は以前、ゼブラフィッシュ胚の後脳領域で神経管の形成を駆動する細胞の挙動を分析するためにこの簡単なアプローチを使用している<sup> 2</sup>。ライブイメージングは、神経胚形成の間に起こる細胞のダイナミクスの理解を可能にするこのアプローチを補完しながら神経管の細胞の形状や組織の前例のない可視化のために許容される固定の準備。
Protocol
Discussion
結論では、標識技術は、ゼブラフィッシュ胚における形態形成のプロセスの単一細胞の分析を可能にするここで説明する。このプロトコルの主な重点は、ユビキタスプロモーターの制御下MGFPを使用して、神経管のイメージング標識細胞のための方法になります。この一過性発現アッセイのリーダーの追加のアプリケーション用にアンデルセンらによる最近の論文を参照する必要があり…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、R.ブリュースター（1R01GM085290 – 01A1）に授与されたNIHの助成金によって支えられている。
Materials
Solutions
- Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O
- Hank’s Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O
- Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
- Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O
- 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
- Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish Practical approach series. , (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
