Görüntüleme Ca Teknikleri 2 + İnsan Sperm sinyal

Summary

[Ca uyaran-uyarılmış^{2 +}] Bireysel insan sperm i sinyalleri değerlendirilir. Hareketli hücreler Ca yüklenir^{2 +} Duyarlı floresan boya (AM-ester yöntemi) ve bir perfusable odasında hareketsiz. Hücreler zaman atlamalı floresan mikroskobu ile görüntülenmiş ve perfüze ortamı üzerinden uyarılır. Yanıtları tek hücreleri (veya bölgeler) Excel kullanarak çevrimdışı analiz edilmektedir.

Abstract

Floresan, Ca yüklü hücreler Floresan mikroskopi^{2 +}-Hassas boyalar, mekansal ve zamansal açıdan Ca ölçümü için kullanılır.^{2 +} Canlı hücreler sinyal. Burada Ca insan sperm süspansiyonlar yüklemek için laboratuvarlarda kullanılan bir yöntem tarif<sup> 2 +</supBoyalar> raporlama ve fizyolojik uyarılma sırasında floresan sinyal ölçüm. Hareketli hücreler doğrudan yüzmeye kadar izole edilmiş ve deney bağlı olarak, 0-24 saat süreyle capacitating koşulları altında inkübe. Ca hücre permeant AM (asetoksi metil ester) ester formu^{2 +} Raporlama boya, saat sitoplazma içine boya yükleme için izin verilen bir hücre kısım ve 1 bir süre sonra eklenir. Hücrelere foto-hasarı en aza indirmek için görünür dalga boyu boyaları kullanabilirsiniz, ancak bu oranlı metrik kayıt mümkün değildir anlamına gelir. Bu yaklaşımın avantajları ve dezavantajları tartışılmıştır. Yükleme süresi hücreleri sırasında bir görüntüleme odasına ve poli-D-lizin kaplı lamel uymak için izin verilir. Yükleme süresini aşan boya ve gevşek hücreleri sonunda perfüzyon cihazı odasının bağlantı kaldırılır. Odasının sürekli perfüze, uyarı ve modifiye Salines sonra perfüzyon başlığına eklenir. Deneyler floresan görüntüleri zaman atlamalı satın alma tarafından kaydedilen ve ilgi alanları elle çizim, detaylı çevrimdışı analiz. Veri Ca (veya bir hücrenin bir parçası), her hücre bir grafik göstermek için, bu tür ön uyaran seviyeleri normalize^{2 +} Floresan% değişim yanıt elde edilir.

Protocol

Normal bir semen analizi ile sağlıklı fertil erkeklerde, sperm, normalde aşağıdaki gibi görüntüleme için hazırlanmıştır. Meni örnekleri, en fazla 30 dakika süreyle 37 ° C'de saklanır. 1.8 CaCl 2 .2 H 2 O, 5.37 KCl, 0.81 MgSO 4 .7 H 2 O, 26.2 NaHCO 3, 1.0 NaH 2 PO 4: mM; Hücreler takviye Earle en dengeli tuz çözüm (sEBSS içine kadar yüzmeye seminal plazma izole edilir. 2H 2 O, 116.4 NaCl, 55.6 D-glukoz, 2.73, Na piruvat, Na laktat 41.8)% 0.3 kömür de-lipidated/fatty asitsiz Kesir V BSA (BSA kalite sperm başarılı kapasitasyonunu için çok önemli) ile desteklenmiştir. SEBBS, 1 ml, 5 ml tüpler bir dizi her pipetlenir ve 0.3 ml meni ile hafifçe underlayered. Inkübasyondan sonra 0.7 ml hafifçe her tüp çıkarılır ve toplanmış; 1 saat (% 6 CO 2 37 ° C) Sperm süspansiyonu 10 ul hücreleri hareketsiz için formalin% 1 (v / v) 90 ul ile seyreltilmiş, daha sonra sperm Neubauer odasında sayılır. Süspansiyon hücre yoğunluğu, daha sonra 6 milyon hücre / ml (sEBSS) ayarlanır. 5-6 saat süreyle kapasitasyonunu izin örnek sonra gevşek kapaklı tüpler ve inkübe (% 6 CO 2 37 ° C) 200 ul hacimde ayrılmıştır Lameller (22×50 mm) daha önce bir poli-D-lizin ile tedavi edilmiştir. Poli-D-lizin solüsyonu (% 10 w / v) 10 ul damla lamel merkezinde küçük bir sayı olarak uygulanır. Poli-D-lizin sonra kurumaya izin verilir. Bu ısıtmalı bir sahne olabilir ve kuruluk tamamlamak olmalıdır. Warner RC20 odasına benzer bir poli-D-lizin-lamel vakum gres kapalı bir amaca yönelik olarak inşa edilen, perfusable, polikarbonat görüntüleme odası (≈ 180 ul kapasitesi boyutları 35 mm x 20 mm x 5 mm) ile bağlı olduğu kaplı lamel hücreleri ters bir mikroskopta incelendi ve 12 mm çaplı dairesel lamel odasının üst yüzey şekilleri, ışık iletimine izin veren bir odasının taban oluşturur. Oregon Yeşil BAPTA1-AM (ÖGB) veya Kalsiyum Yeşil 1-AM etiketleme hücreleri için kullanılır. ÖGB DMSO çözme tarafından hazırlanmıştır. Pluronic asit F127 (deterjan), boya 'topaklanma' önlemek için DMSO yer almaktadır. Bu laboratuar (0.5 ml DMSO 100 mg Pluronic) hazırlanabilir, kullanımdan hemen önce, ya da önceden hazırlanmış olarak satın alınabilir. 20 ul ÖGB (2,5 mg / ml) 50 mg kısım eklenir. Flakon sonra dondurulmuş ve çözülmüş daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Sperm kapasitasyonunu sonra (sEBBS 5-6 saat, 37 ° C,% 6 CO 2) bir tüp, görüntüleme ve 1.2 ul ÖGB çözüm için seçilen 10 mcM bir final konsantrasyon vererek eklenir . Bu tüp daha sonra, hücre süspansiyonu hafifçe P1000 (mavi) pipet ile görüntüleme odasının giriş portu içine enjekte edilir, sonra bir 40 dakika daha inkübe edilir. Odası, 20 dakika boyunca, aşağı inkübatör, poli-D-lizin kaplı lamel tarafına yerleştirilir. Hücreler odasının yüzeyler boyunca yüzmeye eğilimindedir ve poli-D-lizin kaplı alana uyacaktır. Odasına perfüzyon alete bağlanmış ve yaklaşık 0.5 ml / dak perfüze, mikroskop üzerine monte edilmiştir. Bir roller pompa çıkış bağlantı noktası ve taşma haznesi içine tuzlu su kapanı ile bir emme pompası tarafından kaldırılır beslenir. Gevşek hücreler ve ekstrasellüler boya odasının perfüzyon tarafından kaldırılır ederken hazırlanması, en az 10 dakika süreyle karanlıkta bırakılmıştır. Sıcaklık kararlılığı küçük dalgalanmalar sadece hücre Ca 2 + homeostazı etkilemez, çünkü en önemlisi önemli, ama aynı zamanda boya K d etkileyebilir. Deneyler, normalde 25 ° C, bu düzeyde karanlık oda sıcaklığını muhafaza ederek elde etti. Biz istenilen düzeyde oda sıcaklığında muhafaza, ısı kontrollü bir sahne ya da tuzlu su girişi bir termostatik kontrollü ısıtıcı kullanarak daha fazla sıcaklık ve odak istikrar sağladığı bulduk. Hücreler faz kontrast (40x veya 60x oil-immersion) objektif ve görüntüleme için bir alan seçilir altında incelendi. Tuzlu su akışı laminer ve tutarlı olduğu, giriş limanı yakınlarında poli-D-lizin kaplı alanın bölümünü tercih edilir. Hücre yoğunluğu uygun bir alanda kullanmak da önemlidir (aşırı yoğunluk komşu hücrelerden sinyal alma yoluyla verilerin kalitesini ve bütünlüğünü etkiler) ve hücreler yeterince bağlı ama flagellar faaliyet ayırt. Bir faz kontrast görüntü kaydedilir. Net bir floresan (genellikle 50-200 ms) elde etmek için gerekli olan minimum süre azalır ve pozlama mikroskop sonra floresan modunda (emisyon 540 nm eksitasyon 480 nm) açılır. Deney zaman serisi görüntü elde etme yazılımı (IQ) aktive ederek başladı. Tipik olarak 0.1 Hz görüntü elde edilir ve aydınlatma sadece bir softwa kullanarak görüntü elde etme dönemleri ile sınırlıyeniden kontrollü enstantane. Çok daha fazla görüntü elde etme oranları kullanılabilir ancak ödenek beyazlatma sorunları ve hücreleri (tartışma) fotoğraf hasar nedeniyle eserler nesil için yapılmış olmalıdır. IQ (ve diğer birçok kazanım yazılım platformları), deney sırasında gerçek zamanlı grafik floresan sağlayacaktır. 3-5 dakika süresi tuzlu bileşenlerinin manipülasyon (örneğin, [Ca 2 +] o) ve ilaç uygulama kontrol döneminden sonra perfüzyon başlığında tuzlu değiştirilmesi ile elde edilir. Görüntüleme odasında varış o zaman yavaş yanıtlar (0.1 Hz de örneklenmiş) Burada anlatılan değerlendirilmesi için yeterli hassasiyeti sağlayan hesaplanır, böylece her uyarının yanı sıra zamanı olduğunu kaydetti. Daha hızlı tepki için daha doğru Warner RC20 odasında ikinci bir giriş bağlantı noktası üzerinden doğrudan tuzlu su akışı uyaranlara ekleyerek elde edilebilir. Görüntüler IQ kullanarak çevrimdışı analiz edilmektedir. (Faiz (ROI) Bölgeler her bir hücrenin (veya hücre parçası) yuvarlak çizilir ve aynı zamanda bir hücre boş alan yazılım tarafından seçilir (otomatik arka plan çıkarma için resim serisi, akrozom reaksiyon öldü ya da uygulandı hücreleri çıkarmak için kontrol edilir sırasında sitoplazmik boya kaybı) floresan deney ve zaman serisi olarak analiz edildiğinde eserler neden yeterli hareket gösteren bu büyük ve hızlı artış gibi görünür. Bir zaman floresan serisi sonra her bir yatırım getirisi için elde edilir ve bu verileri Excel çevrimdışı analiz edilir. Başlangıçta floresan denklemi kullanarak, kontrol döneminde elde edilen ortalama değeri ile normalize R = [(FF rest) / F geri kalanı] x% 100, R kontrol dönemine göre% değişim floresan nerede, F Floresans şiddeti bir zaman t ve F geri kalanı, kontrol döneminde elde edilen F en az 30 tayin ortalamasıdır. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1, 3 mcM progesteron hücreleri uyarılır edildiği bir deney görüntüleri bir dizi gösterir. Gri-ölçekli üst satır ve film 1 floresan görüntüleri göstermek ve cool 'renkleri floresan yoğunluğu düşük gösterir ve aynı mageler', (Resim J tablo '16_colors arama) 'Pseudocolor de (2 film) aşağıda gösterilmiştir. 'sıcak' renkleri floresan yoğunluğu yüksek göstermektedir. Hücreler, deney sırasında IQ arama tabloları kullanarak Pseudocolor olarak izlenebilir, ama genellikle gri skala kullanarak değerlendirmek için daha bilgilendirici hücreleri iyi etiketli olup olmadığını olabilir. 0 s ve 100 s kayıt başlamadan sonra ilk iki görüntüler toplandı. Floresans istikrarlı ve sonrası acrosomal alan ve sperm boynu güçlü olması eğilimindedir. Progesteron yaklaşık 175 s görüntüleme odasına girdi ve 3. ve 4. görüntüleri (180 ve 220) [+ Ca 2] i (floresan), arka baş ve hücre boyun bölgesi menşeli hızlı bir artış göstermektedir . Daha sonraki görüntülerin ilk çürüme gösteren 290, 360, 740, 990 ve 1440 s, [Ca 2 +], geçici ve ikincil bir sürdürülebilir yükselme gelişme. Şekil 2 normalize floresan her ROI (floresan kontrol dönemine göre% değişim) için ham floresan değerlerini dönüştürürken, bir elektronik tablo analizi gösterir Şekil 3 3 3 mcM progesteron 'tipik' tepkiler gösteren hücreler için zaman normalize floresan araziler gösterir. Şekil 1. Örnek bir hücre veri progesteron ile uyarılır. Gri tonlama (üst sıra) ve (alt sıra) Pseudocolor floresan görüntüleri bir dizi gösterilmiştir. Zaman puan 0, 180, 220, 290, 360 ve 990s. 3 mcM progesteron 175 görüntüleme odasına girdi s ROI'ler ilk panelinde gösterilmiştir. Şekil 2, Excel tek bir hücre floresan veri analizi . Rakamlar siyah renkte floresan veri zaman serisi, dikey olarak düzenlenir. Rakamlar kırmızı (aşağıda), metin içinde verilen eşitlik kullanılarak elde edilen normalize edilmiş verilerdir. Grafik stimülasyon üzerine küçük salınım yavaş bir artış ve dizi floresan geçici bir artış gösterir, bu deneyde hücre 64 normalize floresan zamanlı arsa gösterir. Şekil 3. Floresan zamanlı 3 ayrı hücreler için izleri, saygı değer kontrol etmek için% değişim olarak ifade … 3 mcM progesteron okla işaretli zamanda eklendi. Kesikli çizgi gösterir kontrolü floresan anlamına gelir.

Discussion

Insan spermi spontan ve uyarılmış Ca ^{2 +} sinyalleri dağıtım ve kinetiği kayıt başarıyla yürütülen bu tekniği sağlar. Yanıtları, insan sperm spontan ve uyarılmış ^{Ca 2} + sinyalleri bir çok varyasyon gösterebilir önemlidir hücrelerinin çok sayıda (200) elde edilebilir . Başarılı etiketleme ve kayıt sırasında hücrelerin yaşam örnek kalitesi üzerinde son derece bağımlıdır. Kötü örnekleri kötü etiketleme, kötü tepkiler ve hücreleri kayıt sırasında ölebilir verir.

İnsan sperm foto-hasarı çok hassastır ve bu nedenle hücre sağkalım en üst düzeye çıkarmak ve hücre ölümü nedeniyle eserler en aza indirmek için gerekli minimum aydınlatma (şiddeti ve maruz kalma süresi) kullanın. Yüksek hassasiyetli kamera (düşük yoğunluklu aydınlatma kullanılmasına izin), kamera zayıf floresan pick up beri büyük bir fayda. Back-aydınlatmalı, EM-CCD kameralar çok pahalı olsa da, özellikle çok uygundur. LED aydınlatma (eksitasyon filtresi ile Xenon veya cıva lambası kullanarak yerine hücre sağkalım (Nishigaki ve ark, 2006) geliştirir.

Biz, her oranı için iki görüntü almak için gerekli olduğundan Fura UV ışığı ile uyarma gerektirir çünkü oran-metrik görüntüleme belirgin avantajları rağmen, Fura-2 kullanımı yok. Elde edilen veriler tek bir dalga boyu, görünür ışık boyalar, floresan normalleştirilmesi, hücreler arasındaki boya yükleme fark büyük ölçüde telafi, ama ayrı bir hücre içinde boya dağıtım için, ve bu akılda olmalıdır. Tek bir dalga boyu boyalar, prensip olarak, kalibre edilebilir olsa da, tekniğin doğruluğunu yoksul ve biz bunu yapmaya çalışmayın.

Kalibrasyon olmadan bile Fura-2 (veya emisyon oranı boya indo) ile elde edilen oran, nispi değişiklikler kabul edilebilir sadık bir temsil vermek Oysa [Ca ^{2 +]} i, tek bir dalga boyu boyaların floresan, çok doğrusal [Ca ^{2 +]} i ile ilgili Doyma eğrisinin en yararlı bir bölümü üzerinde tek bir dalga boyu boyalar ilişki genellikle logaritmik olarak yakındır. Şu anda kullandığınız Oregon Yeşil BAPTA-1 (Şekil 4) küçük değişikliklere karşı hassas olması nedeniyle, ^{[Ca 2} +] yakın düzeyde (50-100 nM) dinlenme . ^{[Ca2 +]} 1 mcM yanıtları doyurabilecek floresan değişimi ve boya açısından altında temsil yukarıda i yükselir. UV eksitasyon başvurmadan tekniğin geliştirilmesi için bir seçenek gibi Fluo-3 ve Fura kırmızı bir boya ile yük hücreleri çift. Her ikisi de 488 nM heyecanlı ama aynı anda verdikleri yanıtlara çok farklı olabilir. 540 ve 650 nM emisyon Kayıt doğru izleme için daha iyi bir yöntem sağlayabilir oranı sağlar [Ca ^{2 +]} (Haughland 2002) ve sperm (Nisigaki ve ark, 2006) için geçerli olabilir.

Şekil 4 Oregon Yeşil BAPTA-1 ve Oregon Green BAPTA-2 için ücretsiz [Ca ^{2 +]} (nM) ve pik dalgaboyu (yaklaşık 525 nm) floresans emisyon arasındaki ilişki. OGB1 dinlenme az daha yüksek bir floresan veren [Ca ^{2 +]} böylece, ancak daha düşük düzeyde doymuş yağ asitleri ve küçük kullanışlı bir aralığı vardır . Bu araziler için veriler Moleküler Problar el kitabı (Haughland 2002) elde edilmiştir.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Low light level Camera		QImaging	Rolera XR
Oregon Green BAPTA-1		Invitrogen	06807
Imaging Software		Andor	IQ
Imaging Software		National Institues of Health	Image J	Public domain software
LED illumination system		Cairn Research	Opto LED
Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)		Invitrogen	P3000MP